一种外周血单个核细胞的提取收集方法与流程

1.本发明属于细胞提取技术领域，涉及一种外周血单个核细胞的提取收集方法。


背景技术：

2.分离外周血单个核细胞(pbmc)是临床科研的常规工作，ficoll离心法作为主要分离单个核细胞的方法，通过不同颗粒之间存在沉降系数差，在一定离心力作用下，颗粒各自以一定速度沉降，在密度梯度不同区域上形成区带，从而获取目的细胞。理想状态下，ficoll离心法获取单个核细胞的得率为80-90％，细胞纯度可达到90％以上。但实际操作中，由于抗凝剂的影响，未能得到充足的血液样品而导致实验效果不佳，同时，经过多次离心操作，外周血单个核细胞的增值能力得到损伤，导致提取到的外周血单个核细胞的活性不佳。
3.因此，本发明提供一种外周血单个核细胞的提取收集方法，通过探究不同抗凝剂的使用以及加入增加活性的物质，对分离提取单个核细胞的影响，来提高单个核细胞的增值能力，提高分离提取的成活率，解决以上问题。


技术实现要素：

4.鉴于现有技术中所存在的问题，本发明公开了一种外周血单个核细胞的提取收集方法，采用的技术方案是，包含以下步骤：
5.步骤一：取正常人体外周血加入抗凝剂，制得新鲜抗凝全血20ml；
6.步骤二：将抗凝全血加入到50ml的离心管内，离心处理待其静置分层后，用吸管吸取上层血浆层，获得下层沉淀细胞液；
7.步骤三：在步骤二获得的下层沉淀细胞液中，加入d-hanks溶液，混匀混合，制成细胞悬液；
8.步骤四：另取一支离心管加入ficoll淋巴细胞分层液，用吸管吸取步骤三的细胞悬液，并将其缓慢均匀加注在ficoll淋巴细胞分层液的上层，使得步骤三的细胞悬液浮于ficoll淋巴细胞分层液之上，然后调整离心机转速为1800-2000r/min，离心20min，静置分层，得到分层细胞液；
9.步骤五：将步骤四中得到的分层细胞液，用吸管吸取最上层的血浆层，待血浆层下降至距离单个核细胞上层1mm处，改用毛细吸管吸取剩余的血浆层，直至将其吸完，该过程保持环境温度为4-6度；
10.步骤六：另取一毛细吸管和离心管，将步骤五的单个核细胞层尽量吸完注入离心管内，然后加入d-hanks溶液或者pbs液，然后进行离心处理；
11.步骤七：在步骤六中得到的离心液，静置分层后，用毛细吸管吸取上清液，之后加入微小核糖核酸溶液，低温4-6度，静置8-15min；
12.步骤八：将步骤七得到的细胞悬液，再次进行离心处理，调整离心机转速为1800r/min，离心时间为25min，吸取上层清液，收集底部沉淀，即可得到单个核细胞，取样检测单个
核细胞的数目及活率。
13.作为本发明的一种优选方案，所述步骤一采用的抗凝剂为肝素和edta的混合液。
14.作为本发明的一种优选方案，所述步骤二的离心处理过程为，调整离心机转速为2000-2500r/min，离心20-30min。
15.作为本发明的一种优选方案，所述步骤三加入的d-hanks溶液的体积与步骤二获得的下层沉淀细胞液体积之比为：1:1-1.5:1。
16.作为本发明的一种优选方案，所述步骤四中，加入的ficoll淋巴细胞的体积与细胞悬液的体积与之比为1.2：1。
17.作为本发明的一种优选方案，所述d-hanks溶液或者pbs液的体积为所述步骤五的单个核细胞层的体积的3-6倍。
18.作为本发明的一种优选方案，所述步骤六的离心处理过程为，调整离心机转速为1400r/min，离心15min。
19.作为本发明的一种优选方案，所述步骤七中加入的微小核糖核酸溶液，采用甘草分离提取制备。
20.本发明的有益效果：通过采用肝素和edta的及混合液作为抗凝剂，加入甘草制备的微小核糖核酸，能够进一步提高单个核细胞的增值能力，提高单个核细胞分离提取的活性。
具体实施方式
21.实施例1
22.本发明所述的一种外周血单个核细胞的提取收集方法，采用的技术方案，包含以下步骤：
23.步骤一：取正常人体外周血加入肝素和edta的及混合液作为抗凝剂，制得新鲜抗凝全血20ml；
24.步骤二：将抗凝全血加入到50ml的离心管内，调整离心机转速为2000-2500r/min，离心20-30min，离心处理待其静置分层后，用吸管吸取上层血浆层，获得下层沉淀细胞液；
25.步骤三：在步骤二获得的下层沉淀细胞液中，加入d-hanks溶液，其体积与步骤二获得的下层沉淀细胞液体积之比为：1:1-1.5:1，混匀混合，制成细胞悬液；
26.步骤四：另取一支离心管加入ficoll淋巴细胞分层液，其体积与细胞悬液的体积与之比为1.2：1，用吸管吸取步骤三的细胞悬液，并将其缓慢均匀加注在ficoll淋巴细胞分层液的上层，使得步骤三的细胞悬液浮于ficoll淋巴细胞分层液之上，然后调整离心机转速为1800-2000r/min，离心20min，静置分层，得到分层细胞液；
27.步骤五：将步骤四中得到的分层细胞液，用吸管吸取最上层的血浆层，待血浆层下降至距离单个核细胞上层1mm处，改用毛细吸管吸取剩余的血浆层，直至将其吸完，该过程保持环境温度为4-6度；
28.步骤六：另取一毛细吸管和离心管，将步骤五的单个核细胞层尽量吸完注入离心管内，然后加入3-6倍体积的d-hanks溶液或者pbs液，然后进行离心处理，调整离心机转速为1400r/min，离心15min；
29.步骤七：在步骤六中得到的离心液，静置分层后，用毛细吸管吸取上清液，之后加
入甘草分离提取制备的微小核糖核酸溶液，低温4-6度，静置8-15min；
30.步骤八：将步骤七得到的细胞悬液，再次进行离心处理，调整离心机转速为1800r/min，离心时间为25min，吸取上层清液，收集底部沉淀，即可得到单个核细胞，取样检测单个核细胞的数目及活率。
31.所述步骤八中，单位取样体积内的单个核细胞的成活率为95.4％。
32.实施例2
33.本发明所述的一种外周血单个核细胞的提取收集方法，采用的技术方案，包含以下步骤：
34.步骤一：取正常人体外周血加入肝素或者edta的一种作为抗凝剂，制得新鲜抗凝全血20ml；
35.步骤二：将抗凝全血加入到50ml的离心管内，调整离心机转速为2000-2500r/min，离心20-30min，离心处理待其静置分层后，用吸管吸取上层血浆层，获得下层沉淀细胞液；
36.步骤三：在步骤二获得的下层沉淀细胞液中，加入d-hanks溶液，其体积与步骤二获得的下层沉淀细胞液体积之比为：1:1-1.5:1，混匀混合，制成细胞悬液；
37.步骤四：另取一支离心管加入ficoll淋巴细胞分层液，其体积与细胞悬液的体积与之比为1.2：1，用吸管吸取步骤三的细胞悬液，并将其缓慢均匀加注在ficoll淋巴细胞分层液的上层，使得步骤三的细胞悬液浮于ficoll淋巴细胞分层液之上，然后调整离心机转速为1800-2000r/min，离心20min，静置分层，得到分层细胞液；
38.步骤五：将步骤四中得到的分层细胞液，用吸管吸取最上层的血浆层，待血浆层下降至距离单个核细胞上层1mm处，改用毛细吸管吸取剩余的血浆层，直至将其吸完，该过程保持环境温度为4-6度；
39.步骤六：另取一毛细吸管和离心管，将步骤五的单个核细胞层尽量吸完注入离心管内，然后加入3-6倍体积的d-hanks溶液或者pbs液，然后进行离心处理，调整离心机转速为1400r/min，离心15min；
40.步骤七：在步骤六中得到的离心液，静置分层后，用毛细吸管吸取上清液，之后加入甘草分离提取制备的微小核糖核酸溶液，低温4-6度，静置8-15min；
41.步骤八：将步骤七得到的细胞悬液，再次进行离心处理，调整离心机转速为1800r/min，离心时间为25min，吸取上层清液，收集底部沉淀，即可得到单个核细胞，取样检测单个核细胞的数目及活率。
42.所述步骤八中，单位取样体积内的单个核细胞的成活率为91.3％。
43.实施例3
44.本发明所述的一种外周血单个核细胞的提取收集方法，采用的技术方案，包含以下步骤：
45.步骤一：取正常人体外周血加入枸橼酸钠作为抗凝剂，制得新鲜抗凝全血20ml；
46.步骤二：将抗凝全血加入到50ml的离心管内，调整离心机转速为2000-2500r/min，离心20-30min，离心处理待其静置分层后，用吸管吸取上层血浆层，获得下层沉淀细胞液；
47.步骤三：在步骤二获得的下层沉淀细胞液中，加入d-hanks溶液，其体积与步骤二获得的下层沉淀细胞液体积之比为：1:1-1.5:1，混匀混合，制成细胞悬液；
48.步骤四：另取一支离心管加入ficoll淋巴细胞分层液，其体积与细胞悬液的体积
与之比为1.2：1，用吸管吸取步骤三的细胞悬液，并将其缓慢均匀加注在ficoll淋巴细胞分层液的上层，使得步骤三的细胞悬液浮于ficoll淋巴细胞分层液之上，然后调整离心机转速为1800-2000r/min，离心20min，静置分层，得到分层细胞液；
49.步骤五：将步骤四中得到的分层细胞液，用吸管吸取最上层的血浆层，待血浆层下降至距离单个核细胞上层1mm处，改用毛细吸管吸取剩余的血浆层，直至将其吸完，该过程保持环境温度为4-6度；
50.步骤六：另取一毛细吸管和离心管，将步骤五的单个核细胞层尽量吸完注入离心管内，然后加入3-6倍体积的d-hanks溶液或者pbs液，然后进行离心处理，调整离心机转速为1400r/min，离心15min；
51.步骤七：在步骤六中得到的离心液，静置分层后，用毛细吸管吸取上清液，之后加入甘草分离提取制备的微小核糖核酸溶液，低温4-6度，静置8-15min；
52.步骤八：将步骤七得到的细胞悬液，再次进行离心处理，调整离心机转速为1800r/min，离心时间为25min，吸取上层清液，收集底部沉淀，即可得到单个核细胞，取样检测单个核细胞的数目及活率。
53.所述步骤八中，单位取样体积内的单个核细胞的成活率为88.2％。
54.实施例4
55.本发明所述的一种外周血单个核细胞的提取收集方法，采用的技术方案，包含以下步骤：
56.步骤一：取正常人体外周血加入肝素和edta的及混合液作为抗凝剂，制得新鲜抗凝全血20ml；
57.步骤二：将抗凝全血加入到50ml的离心管内，调整离心机转速为2000-2500r/min，离心20-30min，离心处理待其静置分层后，用吸管吸取上层血浆层，获得下层沉淀细胞液；
58.步骤三：在步骤二获得的下层沉淀细胞液中，加入d-hanks溶液，其体积与步骤二获得的下层沉淀细胞液体积之比为：1:1-1.5:1，混匀混合，制成细胞悬液；
59.步骤四：另取一支离心管加入ficoll淋巴细胞分层液，其体积与细胞悬液的体积与之比为1.2：1，用吸管吸取步骤三的细胞悬液，并将其缓慢均匀加注在ficoll淋巴细胞分层液的上层，使得步骤三的细胞悬液浮于ficoll淋巴细胞分层液之上，然后调整离心机转速为1800-2000r/min，离心20min，静置分层，得到分层细胞液；
60.步骤五：将步骤四中得到的分层细胞液，用吸管吸取最上层的血浆层，待血浆层下降至距离单个核细胞上层1mm处，改用毛细吸管吸取剩余的血浆层，直至将其吸完，该过程保持环境温度为4-6度；
61.步骤六：另取一毛细吸管和离心管，将步骤五的单个核细胞层尽量吸完注入离心管内，然后加入3-6倍体积的d-hanks溶液或者pbs液，然后进行离心处理，调整离心机转速为1400r/min，离心15min；
62.步骤七：在步骤六中得到的离心液，静置分层后，用毛细吸管吸取上清液，低温4-6度，静置8-15min；
63.步骤八：将步骤七得到的细胞悬液，再次进行离心处理，调整离心机转速为1800r/min，离心时间为25min，吸取上层清液，收集底部沉淀，即可得到单个核细胞，取样检测单个核细胞的数目及活率。
64.所述步骤八中，单位取样体积内的单个核细胞的成活率为92.2％。
65.综上所述，实施例1、2、3、4的对比实验的结果详见下表：所述，实施例1、2、3、4的对比实验的结果详见下表：
66.由上表可知，采用肝素和edta混合溶液作为抗凝剂，相比单一的抗凝剂来说，单位取样体积内的单个核细胞的成活率更高，同时，添加甘草制得的微小核糖核酸溶液，更能保持和提高单个核细胞的增值能力，提高其活性。
67.本文中未详细说明的电气连接方式或者结构为现有技术。
68.上述虽然对本发明的具体实施例作了详细说明，但是本发明并不限于上述实施例，在本领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下做出各种变化，而不具备创造性劳动的修改或变形仍在本发明的保护范围以内。