一种Smad4基因检测生物传感器及制备方法与流程

一种smad4基因检测生物传感器及制备方法
技术领域
1.本发明属于基因检测技术领域，涉及一种smad4基因检测生物传感器及制备方法。


背景技术：

2.生物传感器是由生物分子识别元件与各类物理、化学换能器组成，用于各种生命物质和化学物质的分析和检测。电化学dna生物传感器是将dna作为识别元件，并将其浓度转变为电化学信号检测的仪器。电化学dna生物传感器可以分为两类：一类是基于dna杂交的电化学生物传感器，它是在电极表面固定单链dna作为探针，实现对探针互补dna的检测。另一类则是非基因识别的电化学dna传感器，它是在电极表面固定单链或双链dna作为传感器的敏感器件，利用其它物质与dna的作用或者利用dna的特性来实现对特定物质的检测和研究。电化学dna杂交生物传感器是将ssdna分子作为敏感元件固定在电极表面，利用分子杂交技术与目标dna杂交，通过测定电活性物质杂交前后的电化学信号变化来确定目标dna的序列。
3.纳米金即指金的微小颗粒，其直径在1~100nm，其具有高的比表面积和高的表面能，能与多种生物大分子结合，且不影响其生物活性。纳米金除具有一般纳米材料的特性即表面效应、小尺寸效应、量子尺寸效应和隧道量子尺寸效应，同时，金纳米颗粒具有独特的光学性质及促进电子传递的能力。fe3o4的纳米颗粒和纳米复合材料是最重要的磁性材料之一。由于纳米复合材料的多功能，使得生物传感器能够满足快速响应、高灵敏度、高选择性的要求。但仍然存在着制备过程复杂，无法重复使用，成本高等限制其临床使用的问题。cn113584129a提供了p53基因检测探针，由多孔中空的磁性纳米颗粒、封装在多孔中空的磁性纳米颗粒内部的电化学氧化还原活性探针、包覆在多孔中空的磁性纳米颗粒表面的阳离子聚合物功能层以及吸附在功能层表面的捕获dna组成。但该专利采用多孔中空的磁性纳米颗粒的方式对探针进行封装，制备难度高，成功率低。
4.在哺乳动物中发现了8种不同的smad蛋白，即smad1~smad8，可分为3个亚族：受体激活的smads（r-smad）、通用型smads（co-smad）、抑制型smads（i-smad）。在哺乳动物中只发现一种co-smad，即smad4。磷酸化的smad3与smad4结合可防碍smad4与出核受体染色体维持区域1（nuclear export receptor chromosome region maintenance1）的结合使smad4位于核内。smad4的表达和突变，对包括结肠癌在类的多种癌症有着显著的影响，smad4表达异常（突变或数量减少）与肿瘤分化程度及dukes分期相关。由此，提供一种smad4基因检测生物传感器，检测smad4表达异常，对smad蛋白通路的相关研究有着重要的意义。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于开发出一种smad4基因检测生物传感器。
6.基于上述目的，本发明提供了一种smad4基因检测生物传感器及制备方法来满足本领域的这种需要。
7.一方面，本发明提供了一种smad4基因检测生物传感器，其包含smad4基因检测dna
探针；所述smad4基因检测dna探针的核苷酸序列为：5
’‑
sh-（ch2）
6-cataccagtctagacttat-3’。
8.另一方面，本发明提供了smad4基因检测生物传感器的制备方法，其包括：将所述smad4基因检测dna探针溶解在三（2-羧乙基）膦溶液中得到活化的smad4基因检测dna探针；将羟乙基哌嗪乙基磺酸和haucl4·
xh2o、纯水混合，加热搅拌，制备纳米金溶液；将所述活化的smad4基因检测dna探针和所述纳米金溶液在常温下混合，滴加到处理后的金电极表面，37℃下反应1.5h后，浸入到巯基乙醇中，37℃下封闭0.5h。
9.进一步地，本发明提供的smad4基因检测生物传感器的制备方法中，所述金电极的处理方法包括：采用原位化学氧化聚合的方法制备fe3o
4-pani-aunps复合溶液，去除金电极表面氧化层与杂质，浸入hdt乙醇溶液中，4℃下反应1h，再依次用无水乙醇和超纯水清洗电极，超纯氮气吹干，接着浸入到所述fe3o
4-pani-aunps复合溶液中，37℃下放置12h，用水冲洗后晾干。
10.进一步地，本发明提供的smad4基因检测生物传感器的制备方法中，以物质的量比计，所述fe3o
4-pani-aunps复合溶液中fe3o4、pani、aunps的配比为1:1:0.5。
11.另一方面，本发明涉及一种smad4基因检测方法，其使用了上述的smad4基因检测生物传感器。
12.进一步地，本发明提供的smad4基因检测方法中，其包括：将smad4基因检测生物传感器浸入到待检测样本溶液中，37℃反应1h后，依次用pbs缓冲液、0.2%sds、超纯水冲洗电极表面以除去未杂交的目标dna，得到修饰后的金电极进行电化学测定。
13.进一步地，本发明提供的smad4基因检测方法中，所述电化学测定包括：将所述修饰后的金电极在1mmol/l的mb中搅拌浸入20min后，依次在pbs和超纯水中搅拌5min，在pbs溶液中记录杂交后电极的dpv曲线。
14.另一方面，本发明涉及上述smad4基因检测生物传感器在smad4基因检测中的应用。
15.另一方面，本发明涉及上述smad4基因检测方法在smad4基因检测中的应用。
16.本发明与现有技术相比具有以下有益效果或者优点：本发明提供了一种smad4基因检测生物传感器及制备方法，一方面，本发明设计了smad4基因检测dna探针，能实现对smad蛋白通路中smad4基因的检测识别；另一方面，本发明提供了一种smad4基因检测生物传感器，设计了fe3o
4-pani-aunps，实现了探针与电极的结合，能较好的检测到待测样本中smad蛋白通路的电信号变化。
附图说明
17.图1为探针序列与不同浓度的目标序列杂交后的峰电流的变化值。
18.图2为探针序列与相同浓度的不同序列杂交后的峰电流的变化值。
具体实施方式
19.为了使本领域技术人员更好地理解本发明的技术方案能予以实施，下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步说明，但所举实施例不作为对本发明的限定。
20.下述各实施例中所述实验方法和检测方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试
剂和材料，如无特殊说明，均可在市场上购买得到。
21.实施例1本实施例提供了一种smad4基因检测生物传感器的制备。
22.探针：化学合成smad4基因检测dna探针；smad4基因检测dna探针的核苷酸序列为：5
’‑
sh-（ch2）
6-cataccagtctagacttat-3’。
23.fe3o
4-pani-aunps复合溶液制备：以物质的量比计，所述fe3o
4-pani-aunps复合溶液中fe3o4、pani、aunps的配比为1:1:0.5。
24.将50ml质量体积比为0.01%的四氯金酸溶液加热到沸腾，同时伴随着强烈的搅拌。然后2ml质量体积比为1%柠檬酸三钠快速加入沸腾的溶液中。当溶液的颜色从淡黄色变为酒红色，即制得了aunps溶液。
25.取1.25g十二烷基苯磺酸（dbsa）和0.5ml苯胺单体溶解于50ml蒸馏水中，搅拌20min后，滴加含有1.25g（nh）s20s的水溶液25ml，恒温下反应8h。待反应完成后，用chc13萃取，制得pani（dbsa）/chc13溶液。将此溶液与一定量的fecl3·
6h2o和fec12·
4h2o溶液（fecl3·
6h2o和fec12·
4h2o的物质的量比为2：1）混合均匀，回流搅拌下加热进行反应，加入一定量的未冷却的aunps溶液，30min后均匀缓慢滴加热的naoh溶液至ph=7.4，继续反应8h。反应完成后，再次用chc13萃取，蒸馏水洗涤后即为所述fe3o
4-pani-aunps复合溶液。
26.处理后的金电极的处理：氧化铝粉末打磨去除金电极表面氧化层，超声去除金电极表面杂质，浸入2.5mmol/l hdt乙醇溶液中，4℃下反应1h，再依次用无水乙醇和超纯水清洗电极，超纯氮气吹干。浸入到1mol/l fe3o
4-pani-aunps复合溶液中，37℃下放置12h，用水冲洗后晾干。
27.smad4基因检测生物传感器的制备：将所述smad4基因检测dna探针溶解在三（2-羧乙基）膦溶液中得到50μl 3μmol/l活化的smad4基因检测dna探针。将羟乙基哌嗪乙基磺酸和haucl4·
xh2o、纯水混合，加热搅拌，制备纳米金溶液。将50μl 3μmol/l活化的smad4基因检测dna探针和50ml 5mmol/l纳米金溶液在常温下混合，滴加到处理后的金电极表面，37℃下反应1.5h后，浸入到1mmol/l巯基乙醇中，37℃下封闭0.5h。
28.实施例2本实施例提供了一种smad4基因检测生物传感器的检测。
29.目标dna序列：5
’‑
ataagtctagactggtatg-3’；单碱基错配：5
’‑
ataactctagactggtatg-3’；非互补序列：5
’‑
gcggtctcgagtcaacaca-3’。
30.将上述各个序列dna，加入配制浓度所需量的ph 7.4的te缓冲液，然后轻轻盖上管盖，振荡均匀，配制成1.0
×
105mol/l的溶液，冷冻保存。
31.将已组装好的smad4基因检测生物传感器浸入100μl不同浓度的目标dna溶液中，37℃反应1h后，依次用pbs缓冲液、0.2%sds、超纯水冲洗金电极表面以除去未杂交的目标dna，即为杂交后的金电极，然后进行电化学测定。
32.试验采用三电极系统，以杂交后的金电极为工作电极，饱和甘汞电极为参比电极，
铂电极为对电极。在含0.1mol/l kcl的1mmol/l[fe（cn）6]
3-/4-溶液中，电化学工作站记录各修饰金电极的电化学阻抗谱，频率范围为105hz-0.01hz。
[0033]
将smad4基因检测生物传感器在1mmol/l的mb中搅拌浸入20min后，依次在pbs和超纯水中搅拌5min，以除去非特异吸附的mb，在pbs溶液中记录杂交后电极的dpv曲线。在测定之前将pbs缓冲液冲氮20min，以除去氧气。
[0034]
图1为探针序列与不同浓度的目标序列杂交后mb的回归曲线。其峰电流的变化值（δi）与dna浓度对数（lgc
dna
）呈很好的线性关系，回归方程δi=0.7642 lgc
dna +11.084，线性相关系数为0.9992，检出限为1.3
×
10-13
mol/l（σ=3）。
[0035]
为了进一步验证本发明所制备的生物传感器的选择性，通过使用1
×
10-5
mol/l的目标dna序列（td）、单碱基错配靶标（sm）和非互补dna（nc）的不同dna序列的检测信号的变化情况。将smad4基因检测生物传感器在1mmol/l的[ru(nh3)6]
3+
中搅拌浸入20min后，依次在pbs和超纯水中搅拌5min，以除去非特异吸附的[ru(nh3)6]
3+
，在pbs溶液中记录杂交后电极的dpv曲线。在测定之前将pbs缓冲液冲氮20min，以除去氧气。
[0036]
从图2中可以看出，对于与靶标相同浓度的不同dna序列，非互补dna电化学信号很低，对于与目标dna序列相同浓度的单碱基错配靶标dna序列中，单碱基错配靶标（sm）电化学信号低于目标dna序列（td）。对比图1可知，使用[ru(nh3)6]
3+
作为指示剂效果不如mb。结果表明本发明策略构建的生物传感器对目标dna具有良好的选择性和碱基突变分析的区分能力，有巨大的应用潜力。
[0037]
如上所述，即可较好地实现本发明，上述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种改变和改进，均应落入本发明确定的保护范围内。