一种大菱鲆脾脏组织细胞系及其制备方法和应用

1.本发明属于鱼类细胞培养技术领域，具体涉及一种大菱鲆脾脏组织细胞系及其制备方法和应用。


背景技术：

2.大菱鲆(scophthalmus maximus)是一种隶属于菱鲆科(scophthalmidae)、菱鲆属(scophthalmus)的鱼类，是我国重要的经济鱼种。然而，近年来，大菱鲆养殖频繁受到细菌性疾病的干扰，特别是杀鲑气单胞菌(aeromonassalmonicida)、迟发爱德华氏菌(edwardsiella tarda)和鳗弧菌(vibrioanguillarum)，严重制约了大菱鲆养殖的发展。因此，对大菱鲆的免疫系统和疾病机制的研究迫在眉睫。鱼类脾脏组织是鱼类重要的中枢免疫组织，其中分布着大量的t细胞、b细胞和其他免疫细胞，在抵御病原菌入侵过程中发挥着重要的作用。因此分离大菱鲆脾脏组织细胞并培养细胞系，将有助于进行以大菱鲆病原菌致病机制及大菱鲆免疫相关基因功能的研究。
3.细胞培养技术是生物学研究的重要技术，其主要是指从生物体内取出组织或细胞，在体外适当的条件下，使之存活、生长和繁殖，并维持其结构和功能的方法。其细胞系的材料来自于鱼类的各种组织，包括胚胎、脑、眼睛、鳔、骨、肌肉、表皮、鳍条、内脏组织及肿瘤等。相比于直接使用鱼类个体进行实验，利用鱼类细胞系进行实验有操作简便、不受场地季节等约束、重复性高等优势。细胞体外培养应用范围涉及鱼类免疫学、病毒学、分子遗传学、药理学、毒理学、细胞工程育种及种质保存等多种学科。细菌性疾病是对水生生物危害最严重的疾病之一，严重影响我国水产养殖业的发展。随着细胞培养技术的发展，鱼类细胞培养在鱼类疾病学和免疫学研究中的作用也越来越明显。虽然鱼类细胞原代培养技术目前是一种较为成熟的技术，但是要获得稳定传代、适用于实验模型构建的细胞系仍存在较大偶然性及困难性。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种大菱鲆脾脏组织细胞系及其制备方法和应用，所筛选保藏的细胞系传代稳定、存活率高；为大菱鲆脾脏在细菌疾病抵御中的研究提供研究基础，弥补现有技术对鱼类脾脏免疫研究的不足。
5.本发明所提供的大菱鲆脾脏细胞smsp于2022年08月24日保藏在武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no:c2022229，保藏地址：中国武汉。
6.本发明提供的大菱鲆脾脏细胞smsp是从大菱鲆幼鱼脾脏组织构建后筛选获得的，其建立方法包括如下的步骤：
7.1)大菱鲆脾脏组织的获取：
8.取6月龄的大菱鲆幼鱼的脾脏组织，用pbs漂洗后，移入包含有青霉素、链霉素、庆大霉素和两性霉素b的dmem基础培养基中；
9.2)原代培养：
10.将大菱鲆脾脏组织浸泡于75％乙醇中1min，然后浸泡于包含有青霉素、链霉素、庆大霉素和两性霉素b的dmem基础培养基中2小时，然后用pbs 漂洗。最后将大菱鲆脾脏组织用剪刀剪碎至1mm3大小的组织块。将组织块转移到t25的培养瓶中，吸去培养基，仅留一点用于保持湿润，将培养瓶放置于24℃环境中放置2h使组织块贴附于培养瓶底。加入完全培养基培养，最后放置于24℃培养箱中培养；
11.3)传代培养：原代培养至迁出细胞铺满培养瓶底板的80％左右时，吸走培养基，并用pbs清洗除去多余的血清，然后用0.25％的胰蛋白酶消化贴壁细胞，再进行传代培养获得大菱鲆脾脏组织细胞系。
12.在本发明的一个优选实施方案中，所述完全培养液为以dmem+hepes 为基础培养基，包括终浓度分别为15％胎牛血清fbs，5
‰
β-巯基乙醇，1
×
非必须氨基酸(gibco，11140050)，500u/ml青霉素，500μg/ml链霉素， 1.25μg/ml两性霉素b和250μg/ml庆大霉素。
13.本发明再一个方面还提供一种smsp细胞系的培养方法，使用dmem培养基，在温度24℃环境条件下给予10％的胎牛血清的浓度即可维持细胞的快速生长。
14.本发明所提供的大菱鲆脾脏组织细胞系用于免疫功能基因的和病原菌致病机制的研究。在lps和poly(i:c)的刺激下，免疫相关基因tnf-β、il-1β、 il-12a、il-12b和il-10的表达均升高。
15.本发明所提供的大菱鲆脾脏组织细胞系可连续传代，实验结果表明传至 65代并保持稳定，能够提供大量稳定的大菱鲆脾脏细胞，用于免疫功能基因的研究等。所提供的细胞系性状优良，为成纤维细胞，细胞呈梭形或不规则三角形，胞体向外延伸出几个不规则突起，细胞间排列紧密。3-4天传代一次，复苏效率高，并可进行质粒转染、sirna干扰多类分子生物学实验。
附图说明
16.图1：大菱鲆脾脏细胞系原代培养第12天的显微镜照片图(10
×
)，
17.图2：大菱鲆脾脏细胞系复苏后培养24小时的显微镜照片图(10
×
)，
18.图3：大菱鲆脾脏细胞系的染色体分析及核型分布图，
19.图4：大菱鲆脾脏细胞系在不同浓度胎牛血清中培养5天细胞生长检测图，
20.图5：大菱鲆脾脏细胞系在不同温度环境中培养5天细胞生长检测图，
21.图6：大菱鲆脾脏细胞系在不同类型基础培养基中培养5天细胞生长检测图，
22.图7：细胞系转染gfp-sirna 48小时的显微镜照片图，
23.图8：细胞转染pegfp-n1 48小时的显微镜照片图，
24.图9：lps(a)和poly(i:c)(b)刺激2h、6h、12h和24h后smsp中免疫相关基因的表达图。
具体实施方式
25.本发明使用的完全培养液包含dmem+hepes基础培养基、胎牛血清 fbs，β-巯基乙醇、非必须氨基酸、青霉素、链霉素、两性霉素b和庆大霉素。其中dmem培养基、胎牛血清fbs、非必须氨基酸为细胞生长提供必须的营养物质；hepes为细胞提供稳定的生长环境；β-巯基乙醇刺激细胞增殖，提高细胞活性；青霉素、链霉素、两性霉素b和庆大霉素则扩大了抗菌
谱，特别是在原代培养时能有效抑制细菌生长，防止污染。
26.下面结合附图及具体实施方式对本发明的技术方案进行进一步的说明和描述。
27.实施例1：细胞系的构建及筛选
28.构建细胞系所使用的大菱鲆来自于山东烟台海阳黄海水产有限公司，在取样前在温度为18℃，盐度28-30
‰
，中性ph，充足溶解氧的条件下进行养殖。
29.本实施例所使用的基础培养基的组成如下：dmem粉末13.5g (invitrogen，12800-058)+hepes粉末9.528g+1l三蒸水，4℃储存。
30.完全培养基的组成如下：7.5ml胎牛血清(fetal bovine serum，fbs，gibco)+0.5ml 100
×
青霉素-链霉素双抗溶液、终浓度为1.25μg/ml两性霉素b和250μg/ml庆大霉素、50μlβ-巯基乙醇、0.5ml 100
×
非必须氨基酸溶液及40ml基础培养基，4℃储存。
31.细胞冻存液的组分及配比如下：1ml dmso(购自invitrogen公司)+2ml 胎牛血清+7ml完全培养基，现用现配。
32.本发明大菱鲆脾脏细胞系的建立方法的步骤如下:
33.1)将6月龄的大菱鲆幼鱼(长约10cm，重约25g)放入桶中，随后滴入2-3滴丁香酚，直至鱼停止游动，侧躺于桶底，鳃盖张合停止。以浸有75％酒精的棉球擦拭鱼体表面，用灭菌的手术剪分离组织。取出的脾脏组织放入含青霉素-链霉素的pbs溶液的15ml离心管中，后立刻移入超净台进行操作。
34.2)超净工作台中，打开紫外灯灭菌，取脾脏组织。在6孔板中加入3孔的pbs、2孔含有4种抗生素(青霉素、链霉素、庆大霉素和两性霉素b)的 dmem培养基中。将组织依次通过pbs、pbs、pbs、含抗生素dmem(1h)、含抗生素dmem(0.5-1h)。将组织块转移到6cm平皿中，用剪刀或解剖刀将组织切割成小块。将小块的组织块(1mm3)转移到t25的培养瓶中，摆放好组织，吸干多余的培养基，在24℃培养箱中平放培养瓶2h，竖放培养瓶0.5h，加入完全培养基培养。如图1所示，大菱鲆脾脏细胞原代培养后12 天，贴壁细胞及组织块周围即有新细胞迁出，第15天左右有小片细胞簇出现。
35.3)当原代细胞在培养瓶底的覆盖率达到80％左右时，可以进行传代培养。吸走培养基，并用pbs清洗除去多余的血清，然后用0.25％的胰蛋白酶消化贴壁细胞，消化时间约3min，不要晃动培养瓶，吸走胰酶，加入完全培养基吹打，悬浮脾脏细胞，以1:2进行传代。传代后置于24℃培养箱培养。此后每隔3-4天传代一次，直至50代以后。培养期间细胞状态稳定，传代速度快，适合作为实验工具细胞。
36.最终筛选获得的大菱鲆脾脏组织细胞系命名为smsp。
37.实施例2：大菱鲆脾脏细胞smsp的冻存与复苏
38.1)冻存：取一瓶t75培养瓶中处于对数生长期的大菱鲆脾脏细胞系细胞， 0.25％胰蛋白酶消化后离心收集细胞。用冻存液按5
×
105cells/ml冻存液重悬细胞，轻轻吹打细胞沉淀，使其均匀的分散在冻存液中。将细胞悬液分装到冻存管，每管1.5-1.8ml。细胞冻存遵循慢冻原则，4℃放置10min、-20℃放置30min、-80℃放置1天后转移到液氮中保存。
39.2)复苏：细胞复苏遵循速融原则。将冻存管从液氮中取出，迅速放入 37℃水浴锅，轻轻晃动冻存管使其快速均匀解冻，解冻时间不超过1min。将融化的细胞悬液1,200rpm离心5min，除去dmso。用5ml完全培养基重悬离心的细胞，将细胞悬液移入t25细胞培养瓶，置于24℃培养箱中培养。
40.如图2，大菱鲆脾脏细胞系复苏后24h贴壁率达到约80％，与冻存前细胞形态相似，状态良好。
41.实施例3：大菱鲆脾脏细胞smsp的染色体核型分析
42.1)smsp细胞的染色体核型分析在第12代进行。取处于对数生长期的大菱鲆脾脏细胞，用最终浓度为10μg/ml的秋水仙碱，继续培养12h后胰蛋白酶消化细胞，得到细胞悬液。
43.2)将收集到的细胞悬液1,200rpm离心10min，轻轻吸弃上清。加2ml 1
×
pbs到15ml离心管重悬细胞，再加10ml冰水使细胞低渗吸水膨胀。将细胞转移到t75的培养瓶中，室温放置10min。缓慢加入1ml固定液(冰醋酸:甲醇＝1:3)。将细胞转移到15ml离心管中，1200rpm离心7min，小心移去上清，缓慢滴加5ml固定液，小心吹打使细胞重悬，室温放置10min， 1200rpm离心7min。上述步骤重复3次，加0.5ml固定液重悬细胞。将细胞悬液从高处滴落在预冷的载玻片上，自然干燥后用1
×
吉姆萨室温染色10 min。用无酶无菌水轻轻冲洗玻片表面，干燥后中性树脂封片。
44.染色体的数目与核型是细胞遗传学的基础，是鉴定生物种属和性别的重要指标。在细胞培养中，染色体是鉴定细胞来源以及其在培养过程中是否发生转化的重要指标。如图3所示，对大菱鲆脾脏细胞系的染色体分析显示其核型呈近似正态分布；58％观察到的分裂相细胞染色体数目为44条；染色体数目均在单倍体和四倍体之间(22-88条)。综上证明，本发明获得的细胞系与大菱鲆个体染色体数相同。
45.实施例4：大菱鲆脾脏细胞smsp的最佳胎牛血清浓度筛选
46.配制2％、5％、10％、15％和20％ fbs浓度的全培养基。取53代smsp 进行消化，调整细胞浓度，按每孔5
×
104个细胞将smsp细胞接种到48孔板，每种细胞的每种血清浓度接种15个孔，将细胞放入24℃培养箱进行培养。之后每隔24h每种血清浓度中的细胞消化3个孔收集细胞，共收集5天，使用细胞计数仪进行细胞计数，计算每孔细胞总量。以培养时间为横坐标，细胞数为纵坐标，绘制细胞在不同基础培养基条件下的生长曲线，确定细胞生长培养基中适宜的血清浓度，结果如图4所示。smsp细胞在20％的血清浓度中生长最快，其次是15％的血清浓度，5％的血清浓度与10％的血清浓度下 smsp的生长速率基本一致，在2％的血清浓度中细胞也能生长。因此smsp 细胞可以在较低的血清浓度中生长，5％和10％的血清浓度即可满足smsp细胞的稳定生长。
47.实施例5：大菱鲆脾脏细胞smsp的最佳生长温度筛选
48.取53代smsp进行最适生长温度测定。将smsp细胞按每孔5
×
104个细胞接种到6个48孔板中，每个48孔板接种15个孔。将48孔板放入28℃培养箱中培养3h，待细胞贴壁后将48孔板转入16℃、20℃、24℃、28℃和32℃ 5种不同温度的培养箱中培养。之后每隔24h消化3个孔收集细胞，共收集 5天。将收集的细胞用细胞计数仪进行计数，计算每孔细胞总量。以培养时间为横坐标，细胞数为纵坐标，绘制细胞在不同温度条件下的生长曲线，确定smsp细胞的最适生长温度，结果如图5所示。在20℃、24℃和28℃环境中，smsp细胞生长快速，在24℃环境中生长最快。在16℃环境中生长缓慢，在32℃环境中生长受到抑制。因此smsp的最佳培养温度为24℃。
49.实施例6：大菱鲆脾脏细胞smsp的最佳基础培养基筛选
50.配制分别以dmem、dmem:f12、m-199、rpmi-1640和l15为基础培养基的全培养基，取53代smsp进行消化，调整细胞浓度，按每孔5
×
104个细胞将smsp细胞接种到48孔板，每种细
胞的每种基础培养基接种15个孔，将细胞放入24℃培养箱进行培养。之后每隔24h每种细胞消化3个孔收集细胞，共收集5天，细胞计数仪进行细胞计数，计算每孔细胞总量。以培养时间为横坐标，细胞数为纵坐标，绘制细胞在不同基础培养基条件下的生长曲线，确定细胞生长的最佳基础培养基，结果如图6所示。smsp细胞在dmem 和l15的培养基中生长快速，在dmem:f12的培养基中也能快速生长，在 1640的基础培养基中生长较慢，在m199的基础培养基中几乎没有生长。因此，smsp细胞生长的最佳基础培养基是dmem或l15.
51.实施例7：大菱鲆脾脏细胞smsp的sirna转染效果检测
52.提前一天将大菱鲆脾脏细胞接种在24孔板中(3个孔)，以转染时细胞处于对数期且细胞密度在60％左右为宜。利用takara的xfect transfectionreagent转染试剂盒，首先取25pmol gfp-sirna到30μl xfect reactionbuffer中混匀，静置5s后再加入2.5μl xfect rnapolymer混匀，室温放置 10min。吸出24孔板中0.2ml培养基，剩0.3ml/孔，后将转染试剂加入24 孔板。转染6h后，更换为0.5ml新鲜培养基继续培养48h。转染48h后在倒置荧光显微镜下观察细胞转染情况，并拍照记录。
53.rna干扰技术通过抑制转录翻译，以阻止某特定基因的表达，成为后基因组时代验证基因功能和药物靶向的重要工具。转染48h后，在荧光显微镜下镜检，如图7，观察到报告的绿色荧光(gfp)。实验结果表明，建立的大菱鲆脾脏组织细胞系能够适用于小rna干扰实验。
54.实施例8：大菱鲆脾脏细胞smsp的质粒转染效果检测
55.提前一天将大菱鲆脾脏细胞接种在24孔板中(3个孔)，以转染时细胞处于对数期且细胞密度在60％左右为宜。利用takara的xfect transfectionreagent转染试剂盒，首先取1μg pegfp-n1到30μl xfect reaction buffer 中混匀，静置5s后再加入0.3μl xfect polymer混匀，室温放置10min。吸出24孔板中0.2ml培养基，剩0.3ml/孔，后将转染试剂加入24孔板。转染6h后，更换为0.5ml新鲜培养基继续培养48h。转染48h后在倒置荧光显微镜下观察细胞转染情况，并拍照记录。结果如图8所示，观察到报告的绿色荧光(egfp)。实验结果表明，建立的大菱鲆脾脏组织细胞系能够适用于质粒转染实验。
56.实施例9：大菱鲆脾脏细胞smsp在lps和poly(i:c)刺激后免疫相关基因的表达情况检测
57.用lps和poly(i:c)刺激后，检测smsp中促炎细胞因子tnf-β和免疫细胞调节剂il-1β、il-12a、il-12b和il-10的表达。如图9a所示，lps刺激后，所有检测到的基因在smsp细胞中均高表达。其中大部分基因的表达随着lps刺激时间的延长而上调。poly(i:c)刺激后这些基因的表达与lps刺激后基本一致，poly(i:c)刺激后这些基因的表达也上调(图9b)。以上结果表明，smsp可作为大菱鲆的体外研究模型，用于研究病原体的致病机制。
58.以上所述，仅为本发明得较佳实施例，故不能依此限定本发明得实施范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，都应仍属本发明涵盖范围。