1.本发明涉及一种复合菌剂及其制备方法和空间应用，属于微生物技术领域。
背景技术：
2.传统养殖过程中，产生的数量巨大的畜禽粪污及其强烈的刺激性气味，造成了严重的空气、水体以及土壤污染，给农村面源污染治理工作带来了困扰，制约了畜牧业的长远发展，影响着人们的生活质量。恶臭气体中，对人、畜健康影响最大的有害气体是氨气和硫化氢。
3.中国专利文献cn101412975a(申请号200710163670.5)公开了一种有机物处理菌剂及其培养方法、接种方法和在厕所中的应用，包括坚强芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、球形芽孢杆菌，该菌剂用于处理有机垃圾，最终的分解产物为二氧化碳和水蒸气，达到国家排放标准。该菌剂的应用条件需要在特定的恒温、恒湿的搅拌箱体内不断的繁殖并分解有机污物。
4.中国专利文献cn108441447a(申请号201810271418.4)公开了一种新型生物除臭菌剂的制备方法，其制备方法如下：a、菌种选取：按重量配比选取如下微生物菌种：酵母菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、植物乳杆菌和巨大芽孢杆菌；b、一级培养；c、二级培养；d、混合均匀；e、真空冷冻干燥；f、按重量份配比选取活性炭300～320份、硅藻土250～280份和沸石230～270份，并粉碎至粒度为26～35目，并与固态菌粉充分混合均匀制成新型生物除臭菌剂，该发明通过微生物菌种对散发臭味的有机物进行腐熟发酵，将发出臭味的物质分解转化为无臭的物质。
5.中国专利文献cn111821847a(申请号202010734658.0)公开了一种复合生物除臭剂及其制备方法，复合生物除臭剂包括茶粕提取液、茶籽壳提取液、粪肠球菌、巨大芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、甲基营养型芽胞杆菌和沼泽红假单胞菌，其制备方法是将茶粕和茶籽壳的提取液混合稀释后，与发酵后的粪肠球菌、巨大芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、甲基营养型芽胞杆菌和沼泽红假单胞菌组合后的微生物群混合制得的。
6.中国专利文献cn102872475a(申请号201210365005.3)公开了一种除臭降铬的生物制剂及其制备方法，包括如下组分：(1)占总重量10％的复合微生物菌剂，所述复合微生物菌剂由掷孢酵母、球形芽孢杆菌、植物乳杆菌和类球红细菌组成；(2)占总重量90％的微生物载体，组成为麸皮或米糠20-50份；有机膨润土160-300份；水40-80份。
7.生物除臭的方法主要是通过与污染源腐熟发酵除臭，但是直接喷雾至空气中除臭的报道较少。且成分中含有麸皮、米糠、活性炭、硅藻土、沸石等固载物质，以及需要反应箱体等反应容器的菌剂产品，均不适宜空间应用。现有技术中关于微生物除臭剂的报道中，有的是利用制备的微生物除臭剂与散发臭味的有机物进行腐熟发酵，用于去除臭味；有的微生物除臭剂是结合其他物质组合用于臭味去除。
8.现有技术中仅是利用微生物菌剂组合用于空间除臭的研究未见报道。现有技术中也未发现将克劳氏芽孢杆菌、土壤芽孢杆菌用于生物除臭的相关专利文献。
技术实现要素：
9.针对现有技术的不足，本发明提供了一种复合菌剂及其制备方法和空间应用。
10.本发明提到复合菌剂能够直接用于空气喷雾除臭。
11.本发明的技术方案如下：
12.一种复合菌剂，包括克劳氏芽孢杆菌(bacillus clausii)、土壤芽孢杆菌(solibacillus silvestris)、坚强芽孢杆菌(bacillus firmus)、堀越芽孢杆菌(sutcliffiella horikoshii)、巨大芽孢杆菌(bacillus megaterium)、地衣芽孢杆菌(bacillus licheniformis)、蜡样芽孢杆菌(bacillus cereus)和球形芽孢杆菌(bacillus sphaerieus)。
13.根据本发明优选的，所述复合菌剂中，克劳氏芽孢杆菌(bacillus clausii)菌种编号：borwo-1，保藏编号no.202191、土壤芽孢杆菌(solibacillus silvestris)菌种编号：borwo-2，保藏编号no.202192、坚强芽孢杆菌(bacillus firmus)菌种编号：borwo-3，保藏编号no.202193、堀越芽孢杆菌(sutcliffiella horikoshii)菌种编号：borwo-4，保藏编号no.202194、巨大芽孢杆菌(bacillus megaterium)菌种编号：borwo-5，保藏编号no.202195、地衣芽孢杆菌(bacillus licheniformis)菌种编号：borwo-6，保藏编号no.202196、蜡样芽孢杆菌(bacillus cereus)菌种编号：borwo-7，保藏编号no.202197，球形芽孢杆菌(bacillus sphaerieus)菌种编号：borwo-8，保藏编号no.202198；均保藏于山东省科学院生态研究所微生物菌种保藏库。
14.根据本发明优选的，所述复合菌剂中总活菌数为107～10
10
cfu/ml。
15.上述复合菌剂的制备方法，包括如下步骤：
16.(1)菌种活化：将上述8种菌株分别各自接种至无菌液体培养基培养活化，制得菌液；
17.(2)将步骤(1)制得的菌液，分别按照体积分数0.1％～10％的接种量，各自接种至液体培养基，培养制得种子液；
18.(3)菌液培养：将步骤(2)制备的8种菌株的种子液，按照质量比，其中，克劳氏芽孢杆菌、土壤芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、堀越芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌和球形芽孢杆菌的质量比为(0.5～3.5)：(0.5～3.5)：(0.5～1.5)：(0.5～1.5)：(0.5～1.5)：(0.5～1.5)：(0.5～1.5)：(0.5～1.5)组成种子液，按照体积分数1.0-10％的接种量，接种至无菌发酵培养基，在28-37℃、100-200rpm条件下培养12～72h，制备获得复合菌液；
19.(4)步骤(3)制备的复合菌液直接作为复合菌剂；
20.或者，将步骤(3)制备的复合菌液经常温或低温干燥制成可湿性粉剂，获得复合菌剂。
21.根据本发明优选的，步骤(1)中，液体培养基为lb培养基。
22.根据本发明优选的，步骤(1)中，培养条件为28-37℃，100-200rmp，培养时间12-48h。
23.根据本发明优选的，步骤(2)中，液体培养基为lb培养基。
24.根据本发明优选的，步骤(2)中，培养条件为28-37℃，100-200rmp，培养时间12-48h。
25.根据本发明优选的，步骤(2)中，种子液的活菌浓度分别为克劳氏芽孢杆菌的活菌浓度为109～10
10
/ml；土壤芽孢杆菌的活菌浓度为109～10
10
/ml；坚强芽孢杆菌的活菌浓度为107～109/ml；堀越芽孢杆菌的活菌浓度为107～109/ml；巨大芽孢杆菌的活菌浓度为107～109/ml；地衣芽孢杆菌的活菌浓度为107～109/ml；蜡样芽孢杆菌的活菌浓度为107～109/ml；球形芽孢杆菌的活菌浓度为107～109/ml。
26.根据本发明优选的，步骤(3)中，发酵培养基的每升组分如下：
27.酵母粉3.5～15g/l，蛋白胨7.0～15g/l，氯化钠3.5～10g/l，磷酸氢二钾0.5～1.5g/l，磷酸二氢钾0.5～1.5g/l，硫酸镁0.1～0.5g/l，硫酸铵0.5～1.0g/l，氯化钙0.002～0.05g/l，余量水。
28.上述复合菌剂在消除异味中的应用。
29.上述复合菌剂在空间领域中的应用。
30.根据本发明优选的，上述复合菌剂在空间领域消除异味中的应用。
31.根据本发明优选的，所述应用的方法为：将上述复合菌剂用水稀释，按照体积比稀释10～1000倍，置于喷洒设备，喷洒时间1～30分钟，喷洒量为(0.5～1.5)l/min/m3，在异味污染空间内喷洒去除异味。
32.根据本发明优选的，所述异味污染空间为养殖产业异味污染空间。
33.进一步优选的，所述养殖产业异味污染空间包括养殖棚舍、规模养殖场、养殖污水存放区。
34.有益效果
35.1、本发明针对传统养殖过程中产生的强烈的刺激性气味及空间异味污染问题，制备获得的纯微生物复合菌剂，适用于空间领域，在养殖棚舍或规模养殖场异味污染空间内喷洒，可明显快速消除异味，解决养殖场的空间气味问题，氨气降解率可达95％，硫化氢降解效率可达90％，除臭后，在无新的污染源产生的条件下，能够维持6～120h。
36.2、本发明制备的复合菌剂无需额外增加辅料及生产工艺和设备更加简化；可置于自动一体化喷洒设备中，实现定时、定量自动喷洒；在大规模应用于畜禽养殖空间时，能够达到直接、高效、快速除异味目的，实现空气的快速净化。
具体实施方式
37.下面结合具体的实施例对本发明作进一步阐述，但本发明的保护范围不限于此。
38.实施例中使用的药品及试剂，若无特殊说明，则为以上市普通产品，实施例中未详加说明的内容，均按本领域现有技术。
39.微生物来源
40.克劳氏芽孢杆菌(bacillus clausii)菌种编号：borwo-1，保藏编号no.202191、土壤芽孢杆菌(solibacillus silvestris)菌种编号：borwo-2，保藏编号no.202192、坚强芽孢杆菌(bacillus firmus)菌种编号：borwo-3，保藏编号no.202193、堀越芽孢杆菌(sutcliffiella horikoshii)菌种编号：borwo-4，保藏编号no.202194、巨大芽孢杆菌(bacillus megaterium)菌种编号：borwo-5，保藏编号no.202195、地衣芽孢杆菌(bacillus licheniformis)菌种编号：borwo-6，保藏编号no.202196、蜡样芽孢杆菌(bacillus cereus)菌种编号：borwo-7，保藏编号no.202197、球形芽孢杆菌(bacillus sphaerieus)菌
种编号：borwo-8，保藏编号no.202198，上述菌种均为自行分离获得，均保藏于山东省科学院生态研究所微生物菌种保藏库，可以由此购买获得。
41.在实施例中涉及的菌种名称分别简称为“克劳氏芽孢杆菌borwo-1、土壤芽孢杆菌borwo-2、坚强芽孢杆菌borwo-3、堀越芽孢杆菌borwo-4、巨大芽孢杆菌borwo-5、地衣芽孢杆菌borwo-6、蜡样芽孢杆菌borwo-7和球形芽孢杆菌borwo-8”。
42.实验例
43.本发明使用微生物菌种的具体来源，通过下述步骤获得：
44.(1)将放置1年的堆肥样品取1～10g，分别加至50～200ml的mrs液体培养基和nb液体培养基中，置于摇床，在28-37℃、100-200rpm条件下震荡培养12～72h；
45.(2)取上述培养的液体样品0.1～10ml，梯度稀释至10-1
～10-7
，分别涂布0.05～0.5ml至mrs固体培养基和nb固体培养基，在28-37℃、100-200rpm条件下倒置培养12～72h；
46.(3)挑取上述固体平板上正常生长出的菌落进行16s鉴定，获得8种芽孢杆菌，菌株编号分别为克劳氏芽孢杆菌borwo-1(bacillus clausii borwo-1)、土壤芽孢杆菌borwo-2(solibacillus silvestris borwo-2)、坚强芽孢杆菌borwo-3(bacillus firmus borwo-3)、堀越芽孢杆菌borwo-4(sutcliffiella horikoshii borwo-4)、巨大芽孢杆菌borwo-5(bacillus megaterium borwo-5)、地衣芽孢杆菌borwo-6(bacillus licheniformis borwo-6)、蜡样芽孢杆菌borwo-7(bacillus cereus borwo-7)和球形芽孢杆菌borwo-8(bacillus sphaerieus borwo-8)。保藏于山东省科学院生态研究所，保藏地址为济南市历下区经十东路28789号。
47.实施例1
48.一种复合菌剂的制备方法，包括如下步骤：
49.(1)菌种活化：将保存于-80℃的克劳氏芽孢杆菌borwo-1、土壤芽孢杆菌borwo-2、坚强芽孢杆菌borwo-3、堀越芽孢杆菌borwo-4、巨大芽孢杆菌borwo-5、地衣芽孢杆菌borwo-6、蜡样芽孢杆菌borwo-7和球形芽孢杆菌borwo-8的8种菌株，分别按照体积分数0.1％的接种量，各自接种至无菌lb液体培养基，在30℃、150rpm条件下培养48h，充分活化。
50.(2)种子培养：将经充分活化的上述8种菌液，分别按照体积分数0.1％的接种量，各自接种至无菌lb液体培养基，在30℃、150rpm条件下培养24h，制备获得种子液。
51.步骤(2)中，种子液的活菌浓度分别为克劳氏芽孢杆菌的活菌浓度为10
10
/ml；土壤芽孢杆菌的活菌浓度为10
10
/ml；坚强芽孢杆菌的活菌浓度为107/ml；堀越芽孢杆菌的活菌浓度为107/ml；巨大芽孢杆菌的活菌浓度为107/ml；地衣芽孢杆菌的活菌浓度为107/ml；蜡样芽孢杆菌的活菌浓度为107/ml；球形芽孢杆菌的活菌浓度为107/ml。
52.(3)菌液培养：将步骤(2)制备的8种菌株的种子液，按照质量比，其中，克劳氏芽孢杆菌、土壤芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、堀越芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌和球形芽孢杆菌的质量比为3.5：3.5：0.5：0.5：0.5：0.5：0.5：0.5组成种子液，按照体积分数1.0％的接种量，接种至无菌发酵培养基，在30℃、150rpm条件下培养24h，制备获得复合菌液，复合菌液的活菌浓度为107cfu/ml，将该复合菌液作为复合菌剂。
53.发酵培养基的每升组分如下：酵母粉5.0g/l，蛋白胨10.0g/l，氯化钠5.0g/l，磷酸氢二钾1.0g/l，磷酸二氢钾1.0g/l，硫酸镁0.2g/l，硫酸铵0.8g/l，氯化钙0.02g/l，余量水。
54.上述制备的复合菌剂用于养殖棚舍内异味去除，具体方法如下：
55.将上述复合菌液按照体积比稀释10倍，置于喷洒设备，在养殖棚舍内喷洒10分钟，喷洒量为1.5l/min/m3，可消除异味，氨气降解率达91％，硫化氢降解效率可达90％，除臭后，在无新的污染源产生的条件下，能够维持120h。
56.氨气的检测方法依据《gb/t18204.25-2000公共场所空气中氨测定方法》，硫化氢的检测方法依据《gbt14678-93空气质量硫化氢、甲硫醇、甲硫醚和二甲二硫的测定气相色谱法》。
57.实施例2
58.一种复合菌剂的制备方法，包括如下步骤：
59.(1)菌种活化：将保存于-80℃的克劳氏芽孢杆菌borwo-1、土壤芽孢杆菌borwo-2、坚强芽孢杆菌borwo-3、堀越芽孢杆菌borwo-4、巨大芽孢杆菌borwo-5、地衣芽孢杆菌borwo-6、蜡样芽孢杆菌borwo-7和球形芽孢杆菌borwo-8的8种菌株，分别按照体积分数10％的接种量，各自接种至无菌lb液体培养基，在30℃、150rpm条件下培养24h，充分活化。
60.(2)种子培养：将经充分活化的上述8种菌液，分别按照体积分数10％的接种量，各自接种至无菌lb液体培养基，在30℃、150rpm条件下培养12h，制备获得种子液。
61.步骤(2)中，种子液的活菌浓度分别为克劳氏芽孢杆菌的活菌浓度为109/ml；土壤芽孢杆菌的活菌浓度为10
10
/ml；坚强芽孢杆菌的活菌浓度为108/ml；堀越芽孢杆菌的活菌浓度为108/ml；巨大芽孢杆菌的活菌浓度为108/ml；地衣芽孢杆菌的活菌浓度为108/ml；蜡样芽孢杆菌的活菌浓度为107/ml；球形芽孢杆菌的活菌浓度为107/ml。
62.(3)菌液培养：将步骤(2)制备的8种菌株的种子液，按照质量比，其中，克劳氏芽孢杆菌、土壤芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、堀越芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌和球形芽孢杆菌的质量比为0.5：2.5：1.5：1.5：1.5：1.5：0.5：0.5组成种子液，按照体积分数10％的接种量，接种至无菌发酵培养基，在30℃、150rpm条件下培养12h，制备获得复合菌液，复合菌液的活菌浓度为10
10
cfu/ml，将上述复合菌液经低温干燥制成可湿性粉剂，获得复合菌剂。
63.发酵培养基的每升组分如下：酵母粉3.5g/l，蛋白胨7.0g/l，氯化钠3.5g/l，磷酸氢二钾0.5g/l，磷酸二氢钾0.5g/l，硫酸镁0.1g/l，硫酸铵0.5g/l，氯化钙0.002g/l，余量水。
64.上述制备的复合菌剂用于规模养殖场异味污染空间的异味去除，具体方法如下：
65.将上述制备的复合菌剂(可湿性粉剂)用水溶解，按照体积比稀释1000倍，置于喷洒设备，在规模养殖场异味污染空间内喷洒30分钟，喷洒量为1.0l/min/m3，可消除异味，氨气降解率达95％，硫化氢降解效率可达89％，除臭后，在无新的污染源产生的条件下，能够维持84h。氨气、硫化氢的检测方法同实施例1。
66.实施例3
67.一种复合菌剂的制备方法，包括如下步骤：
68.(1)菌种活化：将保存于-80℃的克劳氏芽孢杆菌borwo-1、土壤芽孢杆菌borwo-2、坚强芽孢杆菌borwo-3、堀越芽孢杆菌borwo-4、巨大芽孢杆菌borwo-5、地衣芽孢杆菌borwo-6、蜡样芽孢杆菌borwo-7和球形芽孢杆菌borwo-8的8种菌株，分别按照体积分数1％的接种量，各自接种至无菌lb液体培养基，在30℃、150rpm条件下培养24h，充分活化。
69.(2)种子培养：将经充分活化的上述8种菌液，分别按照体积分数1％的接种量，各
自接种至无菌lb液体培养基，在30℃、150rpm条件下培养15h，制备获得种子液。
70.步骤(2)中，种子液的活菌浓度分别为克劳氏芽孢杆菌的活菌浓度为109/ml；土壤芽孢杆菌的活菌浓度为109/ml；坚强芽孢杆菌的活菌浓度为109/ml；堀越芽孢杆菌的活菌浓度为109/ml；巨大芽孢杆菌的活菌浓度为109/ml；地衣芽孢杆菌的活菌浓度为109/ml；蜡样芽孢杆菌的活菌浓度为109/ml；球形芽孢杆菌的活菌浓度为109/ml。
71.(3)菌液培养：将步骤(2)制备的8种菌株的种子液，按照质量比，其中，克劳氏芽孢杆菌、土壤芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、堀越芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌和球形芽孢杆菌的质量比为1.5：1.5：1.0：1.5：1.5：1.0：1.0：1.0组成种子液，按照体积分数5.0％的接种量，接种至无菌发酵培养基，在30℃、150rpm条件下培养15h，制备获得复合菌液，复合菌液的活菌浓度为109cfu/ml，将上述复合菌液经低温干燥制成可湿性粉剂，获得复合菌剂。
72.发酵培养基的每升组分如下：酵母粉15g/l，蛋白胨15g/l，氯化钠10g/l，磷酸氢二钾1.5g/l，磷酸二氢钾1.5g/l，硫酸镁0.5g/l，硫酸铵1.0g/l，氯化钙0.05g/l，余量水。
73.上述制备的复合菌剂用于规模养殖场异味污染空间的异味去除，具体方法如下：
74.将上述制备的复合菌剂(可湿性粉剂)水溶解，按照体积比稀释500倍，置于喷洒设备，在规模养殖场异味污染空间内喷洒15分钟，喷洒量为0.5l/min/m3，可消除异味，氨气降解率达94％，硫化氢降解效率可达87％，除臭后，在无新的污染源产生的条件下，能够维持96h。氨气、硫化氢的检测方法同实施例1。
75.对比例1
76.采用单一菌株制备相应的菌剂，制备得到只含有巨大芽孢杆菌的菌剂，制得菌液的活菌浓度为109/ml。将上述菌液按照体积比稀释10倍，置于喷洒设备，在养殖棚舍内喷洒10分钟，喷洒量为1.5l/min/m3，未明显消除异味，氨气降解率仅为21％，硫化氢降解率仅为13％。
77.对比例2
78.与实施例1的不同之处，在于用枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis ttl1，z206d4)代替复合菌剂中的土壤芽孢杆菌，其他均相同，制备复合菌剂。
79.将上述复合菌液按照体积比稀释10倍，置于喷洒设备，在养殖棚舍内喷洒10分钟，喷洒量为1.5l/min/m3，氨气降解率达35％，硫化氢降解效率可达19％，除臭后，在无新的污染源产生的条件下，能够维持1h。氨气、硫化氢的检测方法同实施例1。
80.对比例3
81.与实施例1的不同之处，在制备复合菌剂时，不加克劳氏芽孢杆菌，克劳氏芽孢杆菌的用量使用地衣芽孢杆菌代替，其他均相同，制备复合菌剂。
82.将上述复合菌液按照体积比稀释10倍，置于喷洒设备，在养殖棚舍内喷洒10分钟，氨气降解率达51％，硫化氢降解效率可达43％，除臭后，在无新的污染源产生的条件下，能够维持5h。氨气、硫化氢的检测方法同实施例1。
83.对比例4
84.采用单一菌株制备相应的菌剂，制备得到只含有克劳氏芽孢杆菌的菌剂，制得菌液的活菌浓度为109/ml。将上述菌液按照体积比稀释10倍，置于喷洒设备，在养殖棚舍内喷洒10分钟，喷洒量为1.5l/min/m3，未明显消除异味，氨气降解率仅为26％，硫化氢降解率仅
为15％。氨气、硫化氢的检测方法同实施例1。
85.对比例5
86.采用单一菌株制备相应的菌剂，制备得到只含有土壤芽孢杆菌的菌剂，制得菌液的活菌浓度为109/ml。将上述菌液按照体积比稀释10倍，置于喷洒设备，在养殖棚舍内喷洒10分钟，喷洒量为1.5l/min/m3，未明显消除异味，氨气降解率仅为30％，硫化氢降解率仅为22％。氨气、硫化氢的检测方法同实施例1。
87.本发明制备的复合菌剂无需额外增加辅料及生产工艺和设备更加简化；可置于自动一体化喷洒设备中，实现定时、定量自动喷洒；在大规模应用于畜禽养殖空间时，能够达到直接、高效、快速除异味目的，实现空气的快速净化。本发明制备获得的纯微生物复合菌剂，适用于空间领域，在养殖棚舍或规模养殖场异味污染空间内喷洒，可明显快速消除异味，解决养殖场的空间气味问题。