一种利用生淀粉的植物乳杆菌及其应用

1.本发明涉及一种利用生淀粉的植物乳杆菌及其应用，具体涉及一种具有较高的淀粉酶活、不产生对人体有危害的组胺以及能够抑制谷物常见真菌镰刀菌生长的植物乳杆菌，及其应用于制备酸麦芽的方法，属于生物工程技术领域。


背景技术：

2.酸麦芽是指富含乳酸的麦芽，其具有较强的缓冲力，可用于改善碱性的糖化用水，降低糖化醪液的ph值，进而促进酶的作用。据报道，当用酸麦芽醪液使得ph降低0.15-0.25个单位时，能够提高淀粉酶、蛋白酶、外切葡聚糖酶和磷酸酯酶的活性，提高原料利用率。此外，糖化时加入少量的酸麦芽，增加了醪液中低分子氮和可溶性氨的含量，减少单宁的溶解，由此能够提高啤酒的稳定性，改善口感，降低色度，改善泡沫持久性。目前制备酸麦芽的方法主要是将麦芽浸泡在水溶液中，通过接种乳酸菌厌氧发酵，再干燥制得酸麦芽，乳酸含量一般为2％-3％。由于麦芽皮壳的存在，表面营养物质缺乏，没有合适的制备酸麦芽专用的乳酸菌，导致酸麦芽的酸度偏低，仅在2.5％左右，需要在糖化时添加大量的酸麦芽才能达到调酸的目的，啤酒生产使用时性价比不高。
3.因此，在制麦过程中添加乳酸菌，需要考虑大麦表面特殊环境的限制。首先，由于大麦表面的营养物质缺乏，乳酸菌的生长和代谢受到限制。noots等人揭示了乳酸菌在大麦表面的生长依赖于真菌物种通过外壳裂缝或种子胚芽发育引起的其他损害释放的养分。此外，受损大麦的胚乳成分是乳酸菌可利用的潜在碳源，因此作为启动子的乳酸菌需要具有生淀粉利用能力。其次，乳酸菌被认为是发酵食品中生物胺积累的原因，这些生物胺是可引起头痛、腹泻和其他不良反应的生物活性化合物。barbieri发现奶酪中的乳酸菌，特别是瑞士乳杆菌等乳酸杆菌，是此类产品中生物胺积累的原因。此外，同一物种的不同乳酸菌菌株产生的生物胺的种类和数量差异很大。因此，乳酸菌产生生物胺的能力也需要作为选择启动子的标准之一。


技术实现要素：

4.本发明提供一株植物乳杆菌，该植物乳杆菌能够适应大麦表面的环境，具有较高的淀粉酶活、不产生对人体有危害的组胺以及能够抑制对大麦品质有消极影响的禾谷镰刀菌的生长。将该植物乳杆菌应用在麦芽中能够快速成为优势菌，产生大量的酸以及提高麦芽的品质。
5.本发明提供了一种具有较好的淀粉利用能力、不产生对人体有危害的组胺以及能够抑制对大麦品质有消极影响的禾谷镰刀菌的生长的植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)zl-36。所述植物乳杆菌zl-36已于2022年8月5日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏编号为cctcc no：m 20221247。
6.所述植物乳杆菌zl-36为革兰氏阳性菌，菌落呈直杆状，白色凸起，表面光滑；在mrs培养基中，培养液浑浊并且有白色沉淀。
7.所述植物乳杆菌zl-36的保藏方法为：挑取平板上的单菌落于mrs液体培养基，培养24h后吸取1ml菌液于甘油冻存管，并添加1ml的60％甘油。
8.所述植物乳杆菌zl-36的培养条件为：从甘油管中吸取20μl菌液接种于10mlmrs液体培养基，37℃静置活化培养12h,按2％(v/v)转接至100ml mrs液体培养基扩大培养24h。
9.所述植物乳杆菌zl-36能够在含1％(v/v)淀粉的mrs固体培养基上生长。
10.所述植物乳杆菌zl-36在液体脱羧酶培养基上不产生组胺，酪胺、尸胺以及腐胺的生成量也很低。
11.所述植物乳杆菌zl-36的上清液在接种含有禾谷镰刀菌的pda培养基中，可以明显的观察对禾谷镰刀菌的抑制作用。
12.本发明提供了一种微生物制剂，所述微生物制剂含有上述植物乳杆菌zl-36。
13.在一种实施方式中，含有菌浓≥5
×
108cfu/ml的植物乳杆菌zl-36。
14.本发明提供一种制备酸麦芽的方法，所述方法为将上述植物乳杆菌zl-36或上述微生物制剂接种至液体培养基，发酵培养12～24h，获得发酵液，在大麦发芽的阶段，将发酵液喷洒在绿麦芽上，发芽3～5d，将绿麦芽浸泡在水溶液中，然后置于35～38℃培养箱中培养1～3d，发酵结束后，滤干、干燥并将干燥后的麦芽除根即获得酸麦芽。
15.在一种实施方式中，所述干燥的步骤为先45℃下干燥4h，随后在65℃下干燥12h，再在75℃下干燥2h，最后在85℃下干燥3h。
16.在一种实施方式中，将发酵液以质量比0.8～1.2％的添加量喷洒在绿麦芽上。
17.在一种实施方式中，所述发酵液的菌浓≥5
×
108cfu/ml。
18.在一种实施方式中，所述发芽的条件为14℃
±
2℃，相对湿度95％
±
2％。
19.本发明提供了上述植物乳杆菌zl-36和上述微生物制剂在制备食品中的应用。
20.在一种实施方式中，所述食品包括发酵食品和动物食品
21.在一种实施方式中，所述发酵食品包括酸麦芽或酸麦汁。
22.在一种实施方式中，所述动物食品包括饲料或饵料。
23.本发明提供了上述植物乳杆菌zl-36和上述微生物制剂在酿酒领域中的应用。
24.本发明提供了上述植物乳杆菌zl-36和上述微生物制剂在生物防治领域中的应用。
25.在一种实施方式中，利用上述植物乳杆菌zl-36和上述微生物制剂抑制禾谷镰刀菌的生长。
26.有益效果：
27.1、本发明提供了一株植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)zl-36，其淀粉酶酶活达到4.43u/ml，具有较好的淀粉利用能力，可以有效克服大麦表面特殊环境的限制；植物乳杆菌zl-36不产生对人体有危害的组胺，并且酪胺、尸胺及其腐胺的产量也较低，仅有7.5、1.09和1.56mg/l；植物乳杆菌zl-36能够抑制对大麦品质有消极影响的禾谷镰刀菌的生长。
28.2、本发明利用植物乳杆菌zl-36进行酸麦芽的制备，酸麦芽的酸度可达4.2g/100g麦芽，制备的麦芽醪液ph可达到5.4，相较现有技术具有了显著的进步。本发明的原料价格低廉；所用菌株易于保存，易于活化和发酵；生产工艺简单、发酵过程易于控制，得到的产品质量稳定，便于实现大规模工业化生产，具有良好的开发应用前景。
29.生物材料保藏：
30.植物乳杆菌zl-36于2022年8月5日保藏于中国典型物培养物保藏中心，保藏地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号，保藏编号为cctcc no：m 20221247。
附图说明
31.图1实施例3中的对禾谷镰刀菌的抑制能力的鉴定结果(a：对照；b：植物乳杆菌zl-36)
具体实施方式
32.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下通过实施例及试验数据，对本发明作进一步的详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
33.(一)下述实施例中涉及的培养基：
34.1％淀粉-mrs-caco3固体培养基：胰蛋白胨10g，酵母粉5g，吐温80 1ml，磷酸氢二钾2g，无水乙酸钠5g，柠檬酸二铵2g，七水合硫酸镁0.58g，硫酸锰0.29g，可溶性淀粉10.0g，碳酸钙10g，溴甲酚紫5％，琼脂粉18g，蒸馏水定容至1000ml，121℃灭菌20min。
35.mrs液体培养基：胰蛋白胨10g，葡萄糖20g，磷酸氢二钾2g，酵母粉5g，柠檬酸铵2g，硫酸锰0.29g，牛肉膏10g，无水乙酸钠5g，七水合硫酸镁0.58g，吐温80 1ml，蒸馏水定容至1000ml，121℃灭菌20min。
36.mrs-1％淀粉液体培养基：蛋白胨10g，酵母提取物4g，吐温80 1.0ml，磷酸氢二钾2g，乙酸钠5.0g/l，柠檬酸二铵2g，硫酸镁0.2g，硫酸锰0.05g，可溶性淀粉10g。调节ph为6.6
±
0.2，蒸馏水定容至1000ml，121℃灭菌20min。
37.液体脱羧酶培养基：蛋白胨0.5％，酵母浸粉0.5％，牛肉膏0.5％，氯化钠0.25％，葡萄糖0.05％，吐温80 1.0ml，硫酸镁0.02％，七水合硫酸亚铁0.04％，柠檬酸三铵0.005％，磷酸氢二钾0.2％，碳酸钙0.1％，5
’‑
磷酸吡哆醛0.005％，l-组氨酸0.5％，l-酪氨酸0.04％，l-鸟氨酸0.5％，l-赖氨酸0.5％，ph调至5.5，121℃灭菌20min。
38.pda培养基：取土豆200g，去皮切块放入锅中，加入1l蒸馏水，蒸煮土豆至绵软而不烂，纱布过滤，弃去滤渣，滤液中加入葡萄糖20g，琼脂15-20g，溶解后加入蒸馏水定容至1l，121℃灭菌20min
39.cmc培养基：取15g羧甲基纤维素钠用热水溶解，加入1g硝酸钾，0.5g七水合硫酸镁，1g酵母粉，定容至1l，121℃灭菌20min。
40.富集培养基：无菌1％(m/v)可溶性淀粉，0.2％(m/v)进口大豆蛋白胨。
41.(二)下述实施例中涉及到的方法：
42.(1)淀粉酶酶活的测定：
43.待测酶液前处理：将菌液震荡均匀，吸取2ml于离心管中，在1700
×
g，4℃条件下离心15min备用。将mrs-1％淀粉培养基震荡均匀，同时吸取2ml于离心管中，在1700
×
g，4℃条件下离心15min备用。
44.取a(灭活组)、b(实验组)、c(以水为空白组)、d(以mrs-1％淀粉培养基为空白组)、四支ep管，分别加入1％可溶性淀粉溶液500μl和pbs缓冲液100μl，涡旋振荡混匀，于40℃水
浴10min，在b管中加入待测酶液40μl，c管中加水，d管中加离心后的mrs-1％淀粉培养基，混匀，立即计时；40℃准确反应40min后，立即向a、b、c、d管中加入1mol/lnaoh 20μl，混匀后，取出，冰水浴冷却，并于a管中补加热变性酶液(将酶液沸水浴5min)40μl，作为对照。
45.另取四只ep管a1(灭活组)、b1(实验组)、c1(以水为空白组)、d1(以淀粉培养基为空白组)管分别加入100μl水。四只管分别吸取上述a、b、c、d四管溶液各50μl。然后分别加入200μl dns溶液，沸水浴准确反应5min，取出冰水浴2min，从每管中取出20μl，加入到96孔板，再加入250μl水，用枪吹吸几次混匀，540nm下测其od值。
46.计算
47.淀粉酶活力(u/ml)＝(b-a)*1.5*16.5*n
48.b：总还原糖量
49.a：对照管中还原糖量
50.b-a：酶反应生成还原糖含量
51.1.5：反应40min，换算成1h酶活力系数
52.16.5：换算为1ml反应体系
53.n：稀释倍数
54.酶活力单位定义：40℃条件下，每小时生成1mg还原糖所需的酶量定义为一个酶活力单位，表示1u/ml。
55.(2)酸麦芽酸度的测定方法：
56.称取5g破碎后的麦芽加入50ml蒸馏水，震荡1h后过滤。量取5ml滤液进行适当稀释，用0.1mol/l的naoh标准滴定溶液，滴定至微红色30s不褪色，记录消耗0.1mol/l的naoh标准滴定溶液的体积。总酸的含量按照以下公式进行计算：
57.x＝c*(v
1-v2)*0.09*f/m*1000
58.x：试样中总酸的含量，单位为g/100g麦芽
59.c：氢氧化钠标准滴定溶液的浓度，单位为mol/l
[0060]v1
：滴定试液时消耗氢氧化钠标准滴定溶液的体积，单位为ml
[0061]v2
：空白试验时消耗氢氧化钠标准滴定溶液的体积，单位为ml
[0062]
0.09：乳酸的换算系数
[0063]
m：试样的质量(g)
[0064]
1000：换算系数
[0065]
实施例1产淀粉酶的植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)的筛选方法
[0066]
5g大麦皮壳置于装满富集培养基的80ml密封蓝盖瓶中，30℃静置富集5d后开盖，用于分离乳酸菌。量取20ml富集液，置于含180ml无菌生理盐水的密封三角瓶内，120r
·
min-1
在30℃振荡1h，获得10-1
梯度滤液，进行梯度稀释。选取10-5
、10-6
、10-7
这3个梯度，各取稀释液80μl，涂布于1％淀粉-mrs-caco3固体培养基中，放置于厌氧罐中，37℃倒置培养5-7d进行产淀粉酶乳酸菌的分离。观察不同平板上形成的菌落，挑取长势较好并且具有黄色水解透明圈的单菌落进行不断纯化培养，平板上的菌落大小、形态一致，为纯种，并用甘油管在-20℃保藏。
[0067]
将上述得到的菌株进行产淀粉酶活的测定。将菌株先用mrs液体培养基活化，再以2％(v/v)的接种量接种至mrs-1％淀粉液体培养基扩大培养，37℃厌氧培养12h后取菌液进
行酶活力测定。选取酶活力最强的菌株zl-36于液体mrs培养基中，37℃静置培养24h，进行16s dna测序鉴定，测序结果显示具有序列表中seq id no.1的核苷酸序列，确定该菌株为植物乳杆菌lactobacillusplantarum，命名为植物乳杆菌lactobacillusplantarum zl-36，淀粉酶酶活为4.43u/ml。
[0068]
实施例2lactobacillusplantarum zl-36的安全性测试
[0069]
将实施例1中筛选到的植物乳杆菌zl-36以2％(v/v)的接种量接种于3mlmrs液体培养基中，30℃培养活化两代。然后按照1％(v/v)的接种量将植物乳杆菌zl-36接种于含有10ml液体脱羧酶培养基的试管中，30℃静置培养4d。利用不添加氨基酸底物的空白培养基作为对照，发酵结束后，3600g下离心10min，吸取1ml上清液加入1ml的0.1mol/l盐酸后进行衍生化。衍生结束后，利用uhplc测定组胺、酪胺、尸胺及其腐胺的含量。测定结果显示植物乳杆菌zl-36不产组胺，酪胺、尸胺及其腐胺的产生量分别为7.5、1.09和1.56mg/l。
[0070]
实施例3lactobacillusplantarum zl-36的抑禾谷镰刀菌能力测试
[0071]
植物乳杆菌zl-36上清液的制备：将植物乳杆菌zl-36接种到mrs液体培养基中于37℃下培养24h，5000g下离心10min，0.22μm滤膜过滤，得到无细胞上清液。
[0072]
将禾谷镰刀菌接种到pda培养基上，30℃培养3d，挑取部分菌丝接种到cmc培养基中，在200r
·
min-1
摇床中震荡培养3-5d至产生大量孢子，过滤后离心，利用血球计数板进行计数，备用。将无菌牛津杯置于mrs琼脂平板的中心，然后加入10ml的含有禾谷镰刀菌孢子(1
×
106个/ml)的pda软琼脂(0.7％琼脂)。软琼脂固化后，将100μl的植物乳杆菌zl-36的无菌上清液滴在牛津杯中，随后将平板在30℃下培养48h，以不添加植物乳杆菌zl-36上清液的培养基作为空白，测定植物乳杆菌zl-36的抑菌效果。
[0073]
结果如图1所示，可以明显的观察植物乳杆菌zl-36的上清液对禾谷镰刀菌具有明显抑制作用。
[0074]
实施例4利用lactobacillusplantarum zl-36制备酸麦芽
[0075]
植物乳杆菌zl-36发酵液的制备：将植物乳杆菌zl-36接种到mrs液体培养基中于37℃下培养24h。
[0076]
大麦经过挑选、浸麦后，在发芽开始时将植物乳杆菌zl-36的发酵液以1％(m/m)的添加量喷洒到绿麦芽表面，发芽第四天后，将绿麦芽浸泡在水溶液中，然后置于37℃培养箱中培养2d，发酵过程中不断翻动麦芽。发酵结束后，先在45℃下干燥4h，随后在65℃下干燥12h，再在75℃下干燥2h，最后在85℃下干燥3h。将干燥后的麦芽除根。最终大麦的酸度可达到4.2％，制备的麦芽醪液ph可达到5.4。
[0077]
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。