单拷贝的番木瓜基因及利用其检测转基因番木瓜中外源基因拷贝数的方法

本发明属于生物，具体涉及利用数字pcr和荧光定量pcr检测转基因番木瓜中外源基因拷贝数的方法及其应用。

背景技术：

1、自1996年首例转基因农作物产业化应用以来，全球转基因技术研究与产业应用快速发展。转基因植物是基因组中含有外源基因的植物，有可能改变植物的某些遗传特性，培育高产、优质、抗病毒、抗虫、抗寒、抗旱、抗涝、抗盐碱、抗除草剂等的作物新品种。外源基因整合进入受体植物基因组的情况对转基因植物的目的性状的获得至关重要，其中，外源基因整合进入受体植物基因组的拷贝数会影响外源目的基因的表达及其遗传稳定性。当外源基因以1-2个拷贝数整合到受体基因组时，一般能够稳定高效的表达，而当外源基因以多拷贝数整合到受体基因组时，可能会出现表达水平较低甚至基因沉默，从而无法得到表现目的性状的转基因植株。因此，研究人员在筛选转基因t0代株系时往往会选择单低拷贝整合的转基因株系，因为单低拷贝整合的转基因植物后代的遗传稳定性、基因表达水平及存活率都较高。然而，单低拷贝整合的转基因t0代株系的筛选，往往需要从上百个株系中筛选，此外，纯合转基因植株的获得，也需要从性状分离了的t1代转基因植株中筛选。因此，外源基因拷贝数的检测是转基因植物育种的重要环节，简单、快速、高效、高通量的外源基因拷贝数检测方法非常重要。

2、传统的检测转基因植株中外源基因拷贝数的方法为southern杂交，该方法特异性强、灵敏度高，其准确性已经得到了大家的普遍认可，但其对样品dna的量与纯度要求较高，且成本高，周期长，难以满足高通量外源基因拷贝数检测的需求。荧光定量pcr也常用于转基因植株中外源基因拷贝数的检测，可分为荧光染料法和探针法，探针法相比于染料法，能更精确地对低拷贝的目的dna片段进行定量分析，但探针价格较昂贵，成本高。染料法虽然相较于探针法精准度稍有降低，但在检测单低拷贝外源基因时的准确性也足以满足育种工作需求，其成本较低，更适宜高通量检测。目前，荧光定量pcr测定外源基因拷贝数已成功应用于转基因水稻和棉花等作物的拷贝数检测。数字pcr技术是在荧光定量pcr技术基础上的一次技术革新，其分析结果可直接得出dna分子的个数，对起始样品进行绝对定量。相比荧光pcr，数字pcr具有更好的测量独立性，且无需任何校准物，具有更高的灵敏度、特异性和准确性。研究表明，数字pcr能够简单而准确地测定水稻、柑橘、马铃薯、玉米、番茄和小麦中的外源基因拷贝数。

3、番木瓜是世界四大热带、亚热带畅销水果之一。番木瓜生产上最大的限制是番木瓜病毒病，在抗病杂交育种难以开展的情况下，转基因技术被引入了番木瓜育种，最早开展的是转基因抗病毒病育种，第一个转基因番木瓜品种是利用品种sunset的胚性愈伤组织进行基因枪转化得到的，该品种转入了一个温和的夏威夷番木瓜环斑病毒(papaya ringspotvirus，prsv)55-1的外壳蛋白(coat protein，cp)基因，田间抗性表现相当良好，1997年在夏威夷获得商业化应用。2008年美国弗罗里达大学转化prsv x17-2株系cp基因的番木瓜x17-2品系获得商业化应用。我国的番木瓜转基因技术研究是从1996年开始的，华南农业大学研发出了第一个转基因番木瓜“华农1号”，并且在2010年获得了国家颁发的番木瓜农业转基因生物安全证书，获准正式引进转基因番木瓜商业种植。近些年来，研究人员仍在不断进行新的番木瓜转基因育种研究，传统的southern杂交法难以满足大量转基因株系中外源基因拷贝数检测的需求，因此，亟需一种简单、快速、高效、高通量的检测转基因番木瓜的拷贝数的方法。

技术实现思路

1、为解决上述技术问题，本发明提供了一种单拷贝的番木瓜基因，以及利用该单拷贝基因通过与数字pcr和荧光定量pcr技术结合检测番木瓜外源转基因拷贝数的方法。

2、本发明的技术方案为：本发明提供了两个番木瓜单拷贝基因作为拷贝数检测的内参基因，以转基因番木瓜最常用的筛选标记基因nptⅱ(neomycin phosphotransferase)为外源目的基因，利用数字pcr与荧光定量pcr技术实现转基因番木瓜中外源基因拷贝数的快速高通量检测。具体的：

3、一种单拷贝的番木瓜基因，该基因为cpa03g018830或cpa03g018770、且均来自于番木瓜chr_03染色体，所述基因cpa03g018830的正向检测引物序列如seq no.1所示、反向检测引物序列如seq no.2所示，所述基因cpa03g018770的正向检测引物序列如seq no.4所示、反向检测引物序列如seq no.5所示。

4、一种单拷贝的番木瓜基因的应用，所述基因cpa03g018830或cpa03g018770作为内参基因用于检测转基因番木瓜中外源基因的拷贝数。

5、进一步的，转基因番木瓜以nptⅱ筛选标记基因为外源目的基因，所述nptⅱ筛选标记基因的正向检测引物序列如seq no.9所示、反向检测引物序列如seq no.10所示。

6、一种利用数字pcr检测转基因番木瓜中外源基因拷贝数的方法，以基因cpa03g018830或cpa03g018770的正向和反向检测引物、nptⅱ筛选标记基因的正向和反向检测引物对样品番木瓜基因组dna利用数字pcr技术进行检测，以样品中外源目的基因与内参基因的拷贝数比值判断外源目的基因在转基因番木瓜基因组中的拷贝数。

7、进一步的，使用quantstudiotm3d analysissuitetm数字pcr仪(赛默飞世尔科技限公司)，数字pcr技术进行检测时反应体系条件为：2×ddpcr master mix 7.30μl，内参基因和外源基因的正向引物和反向引物(10μm)各1.30μl，探针(10μm)各0.36μl，dna模板(10ng/μl)1μl，nuclease-free water 0.28μl，总体积14.50μl。扩增程序如下：96℃10min；60℃2min，98℃30s，39个循环；60℃2min。

8、进一步的，转基因番木瓜基因组中外源目的基因拷贝数的判断方法为外源目的基因与内参基因的拷贝数比值为0.5时为单拷贝、比值为1时为双拷贝、比值为1.5时为三拷贝，其它多拷贝外源基因拷贝数以此类推。具体的：上述数字pcr反应结束后，将芯片放入数字pcr读取仪中读取fam和vic荧光信号，并使用quantstudiotm3d analysissuitetmsoftware进行荧光数据分析，得到检测样品dna中外源目的基因和内参基因的拷贝数(copy/μl)，计算样品中外源目的基因与内参基因的拷贝数比值，通过比值判断外源目的基因在转基因番木瓜基因组中的拷贝数。番木瓜是二倍体且内参基因在番木瓜中为单拷贝，因此以单拷贝整合的外源目的基因片段与内参基因的拷贝数比值约为0.5，双拷贝整合的外源基因片段与内参基因的拷贝数比值约为1，三拷贝整合的外源基因片段与内参基因的拷贝数比值约为1.5，四拷贝、五拷贝等多拷贝外源基因片段整合拷贝数以此类推。

9、进一步的，利用基因cpa03g018830作为内参基因时其探针序列如seq no.3所示，利用基因cpa03g018770作为内参基因时其探针序列如seq no.6所示，nptⅱ筛选标记基因的探针序列如seq no.12所示。

10、一种利用荧光定量pcr检测转基因番木瓜中外源基因拷贝数的方法，以基因cpa03g018830或cpa03g018770的正向和反向检测引物、nptⅱ筛选标记基因的正向和反向检测引物对样品番木瓜基因组dna利用荧光定量pcr技术进行检测，采用2-δδct法分析转基因番木瓜中nptii筛选标记基因的相对拷贝数，以相对定量值判断外源目的基因在转基因番木瓜基因组中的拷贝数。

11、进一步的，荧光定量pcr技术进行检测时以纯合单拷贝转基因番木瓜株系作为参照模板，反应体系条件为：2x q3 sybr qpcr master mix 10μl，正向引物和反向引物(10μm)各0.4μl，template dna(50ng/μl)1μl，ddh2o 9.2μl，总体积为20μl。扩增程序为：95℃预变性30s；95℃变性10s，58℃退火30s，40个循环；熔解曲线95℃15s，60℃60s，95℃15s。每个样品重复3次。

12、进一步的，转基因番木瓜基因组中外源目的基因拷贝数的判断方法为：以已知单拷贝纯合转基因植株对照为参照因子，即为1，各样本相对于参照因子拷贝数的倍数为2-δδct，单拷贝植株的相对表达量为0.5、双拷贝植株的相对表达量为1、三拷贝植株的相对表达量为1.5，多拷贝外源基因整合拷贝数以此类推。具体的：

13、荧光定量pcr反应结束后，使用96sw 1.1系统对数据进行分析，采用2-δδct法分析转基因植株中nptii基因的相对拷贝数，定义已知单拷贝纯合转基因植株对照为参照因子，即为1，各样本相对于参照因子拷贝数的倍数为2-δδct。由于t0代植株的插入为杂合型，因此单拷贝植株的相对定量值(rq)应为纯合单拷贝参照的1/2，相对表达量约为0.5；而双拷贝植株的rq值与纯合单拷贝对照相等，相对表达量约为1；三拷贝植株的相对定量值rq应该为纯合单拷贝对照的3/2，相对表达量约为1.5；多拷贝外源基因整合拷贝数以此类推。

14、本发明的有益效果为：

15、本发明的目的在于提供了利用数字pcr和荧光定量pcr技术高通量检测转基因番木瓜外源基因拷贝数的方法，具有简单快速、样本要求低、高效、高通量等特点，提高大规模转基因株系筛选的效率，可为转基因番木瓜育种研究中外源基因拷贝数的检测方法提供新的选择。

16、本发明提供的2个番木瓜单拷贝基因，可作为内参基因应用于转基因番木瓜外源基因拷贝数的检测；本发明提供的一种利用数字pcr技术检测转基因番木瓜中外源基因拷贝数的方法，可用于所有以nptⅱ为筛选标记的转基因番木瓜的拷贝数检测。该方法为绝对定量，准确度高，简单快速，样本需求量少，能批量检测；本发明提供的一种利用荧光定量pcr技术检测转基因番木瓜中外源基因拷贝数的方法，可用于所有以nptⅱ为筛选标记的转基因番木瓜的拷贝数检测。该方法简单快速，成本低，样本需求量少，其准确性足以满足检测单低拷贝的育种需求，更适合批量检测。