采用两步酶法生产高EPA乙酯和高DHA甘油酯的方法

采用两步酶法生产高epa乙酯和高dha甘油酯的方法
技术领域
1.本发明属于油脂改性领域，具体涉及采用两步酶法生产高epa乙酯和高dha甘油酯的方法。


背景技术：

2.大量临床实验表明，n-3多不饱和脂肪酸如二十碳五烯酸（epa）和二十二碳六烯酸（dha）是一类对人体健康有益的活性物质。研究证实，epa有助于保持血管畅通，预防血栓产生，阻止中风或心肌梗塞的发生，清除血液中堆积的脂肪，预防动脉硬化及阻止末梢血管阻塞的发生（zhang h j , gao x , guo x f , et al. effects of dietary eicosapentaenoic acid and docosahexaenoic acid supplementation on metabolic syndrome: a systematic review and meta-analysis of data from 33 randomized controlled trials[j]. clinical nutrition, 2021, 40(7): 4538-4550.）；dha是大脑细胞形成、发育及运作不可缺少的物质基础，可以促进、协调神经回路的传导作用，以维持脑部细胞的正常运作，预防老年痴呆症（jin j, jin q z, wang x g, et al. high sn
ꢀ‑
2 docosahexaenoic acid lipids for brain benefits, and their enzymatic syntheses: a review[j]. engineering, 2020, 6( 4): 424-431.）。然而人类自身只能合成有限的epa和dha（转化率约为5 %）。因此，富含epa和dha的营养补充剂受到消费者的青睐。
[0003]
目前，由鱼油制备的epa和/或dha甘油酯或乙酯是人类补充n-3多不饱和脂肪酸的重要来源。rubio-rodr
í
guez等人提出观点，乙酯型或甘油酯型的epa或dha更容易被人体所利用，并表现出更好医药效果（rubio-rodr
í
guez n, beltr
á
n s, jaime i, et al. production of omega-3 polyunsaturated fatty acid concentrates: a review[j]. innovative food science & emerging technologies, 2010, 11(1): 1-12.）。但是，利用鱼油所开发的乙酯型或甘油酯型的营养补充剂制品都会同时存在较高浓度的epa和dha这两种n-3多不饱和脂肪酸。例如，blackmores品牌的鱼油omega3软胶囊的dha和epa含量分别为12%和18%；nyo3品牌的高浓缩深海鱼油的epa和dha比例为4：3。大量研究表明，在特定疾病的治疗中，epa或dha单独使用的效果要强于epa和dha联合使用。同时食用高浓度的epa和dha制品，会导致机体对epa和dha的吸收代谢产生相互干扰，影响epa与dha各自生物学功能的实行(deckelbaum r j and calder p c. is it time to separate epa from dha when using omega-3 fatty acids to protect heart and brain[j]. current opinion in clinical nutrition and metabolic care. 2022, 23(2): 65-67.)。基于此，科技工作者一直致力于将鱼油的epa与dha进行富集并分离，得到富含epa与dha的两种生物制品。
[0004]
目前科技工作者主要是通过物理或者化学方法来分离epa与dha。夏尧干等人研究了超临界流体色谱技术来分离epa与dha（夏尧干,王宇,邹雯燕等.鱼油脂肪酸epa和dha的分离影响研究[j].淮阴工学院学报,2020,29(05):49-52.）。董倩研究了ee型epa与dha富集和分离的方法，首先通过尿素包埋法将ee型的dha和epa浓度富集至80.49%，再通过固定床
谱法进一步富集epa和dha浓度至99%，最后通过模拟移动床色谱法分离epa和dha，epa-ee和dha-ee的浓度分别可达91.6%和93.6%（董青. epa-ee和dha-ee的分离工艺研究[d].浙江大学,2018.）。但以上方法都不利于工业化生产的应用。与化学催化法相比，酶催化法富集和/或分离epa与dha，其反应条件温和，酶表现底物选择性，epa与dha的氧化程度较低，易放大可用于工业级规模生产。与其他酶催化法（如水解反应、甘油解反应）相比，脂肪酶乙醇醇解催化鱼油富集epa和dha受到了广泛的关注。其原因如下：1）乙醇是绿色溶剂，价格便宜且可再生；2）乙醇即可作底物又可作介质，分离纯化方法简单；3）产物主要为乙酯与甘油酯，epa/dha以乙酯或甘油酯形式容易被人体吸收和利用（he y, wang x, zhang y, et al. enzymatic ethanolysis subjected to schizochyrium biomass: sequential processing for dha enrichment and biodiesel production[j]. energy conversion and management, 2019, 184(mar.): 159-171.）。he等人研究发现，脂肪酶cal-a具有脂肪酸选择性或者弱sn-2位置选择性（he y, li j, kodali s, et al. the near-ideal catalyic property of candida antarctica lipase a to highly concentrate n-3 polyunsaturated fatty acids in monoacylglycerols via one-step ethanolysis of triacylglycerols[j]. bioresource technology, 2016:466-478.），而脂肪酶cal-b、ns、tl、et具有sn-1，3位置特异选择性（he y, li j, kodali s, et al. liquid lipases for enzymatic concentration of n-3 polyunsaturated fatty acids in monoacylglycerols via ethanolysis: catalyic specificity and parameterization[j]. bioresource technology, 2016, 224: 445-456.）。在上述这些脂肪酶中，cal-a乙醇醇解催化鱼油表现最强的epa和dha富集能力，即epa和dha含量分别可达50.86%和26.3%。另一方面，实验结果表明，这些脂肪酶只是拥有富集epa和dha能力，尚未表现出分离epa和dha的特性。在taiwo等人的研究工作中发现鱼油的epa和dha在甘油骨架中的分布特性为：dha主要分布于甘油骨架的sn-2位置，而epa均匀分布于甘油骨架的三个位点上（taiwo o a, jacqui l a, colin j b. selective concentration of epa and dha using thermomyces lanuginosus lipase is due to fatty acid selectivity and not regioselectivity[j]. food chemistry, 2013,138(1): 615-620.）。因此，这些已报道的研究工作结果可推测，若仅选择具有sn-1，3位置特异性脂肪酶一步酶催化乙醇解鱼油，则sn-2位置饱和脂肪酸、单不饱和脂肪酸以及epa无法被有效移除。而选择具有脂肪酸选择性的脂肪酶，虽然可以有效地提高产物中n-3多不饱和脂肪酸，但无法将epa和dha进行有效的分离。因此，亟需寻找一种高效富集与分离鱼油的epa和dha的规模生产方法，即研发利用脂肪酶醇解催化鱼油先高效富集鱼油的epa和dha，再分离epa和dha的方法。
[0005]
中国专利cn112592939b公开了一种酶法富集n-3多不饱和脂肪酸的方法。该发明以鱼油为原料，采用的脂肪酶包括来源于candida cylindracea的一种或几种脂肪酶和脂肪酶candida antarctica lipase a，以醇解和水解两种反应方式。先取油脂、水溶液和来源于candida cylindracea的脂肪酶于反应器中反应，反应一定时间后，得混合物。脱除混合物中的游离脂肪酸后，可得到富含n-3多不饱和脂肪酸的油脂。再将获得的油脂、醇的水溶液和脂肪酶candida antarctica lipase a于反应器中反应，反应一定时间后，得混合物，经过纯化后，即可得到富含n-3多不饱和脂肪酸油脂。该发明采用了两种具有脂肪酸选择性的脂肪酶candida cylindracea lipase和脂肪酶candida antarctica lipase a，有
效地提高了鱼油中n-3多不饱和脂肪酸的含量。但是该方法中采用了酶催化水解反应，反应过程中产生的副产物为游离脂肪酸，分离纯化复杂。同时，该发明中选择的脂肪酶都为脂肪酸选择性酶，无法有效地分离epa和dha，限制了油脂中epa和dha的浓度。
[0006]
中国专利cn111647633b公开了一种富集深海鱼油中epa和dha的方法。该发明将sn-1,3位置选择性脂肪酶溶解在tris-hcl缓冲液中，再加入酰基迁移促进剂二氧化硅颗粒，通过磁力搅拌制备含有脂肪酶和二氧化硅的分散体。添加深海鱼油于制备好的分散体系中，反应过程中充入氮气密封，并且不断磁力搅拌。反应结束后，向反应体系中添加氢氧化钾溶液和正己烷，充分震荡后离心，转移收集上层溶液并利用氮吹去除正己烷，除去正己烷后的余液即为富含epa和dha的脂质。该发明采用sn-1，3位置选择性脂肪酶，无法有效去除sn-2位上的饱和以及单不饱和脂肪酸。并且该方法工艺复杂，程序繁琐，不利于大规模工业生产。
[0007]
中国专利cn112521270b公开了一种通过高真空连续精馏法分离dha和epa方法。该发明将乙酯型鱼油预热后加入脱气塔脱除低沸物，脱除低沸物的产物再进入生物柴油分离塔，从塔顶分离出生物柴油。剩余物料再进入dha与epa分离塔，塔顶分离出epa，剩余物料依次经过两级刮板蒸发器，分别得到dha组分和重沸物组分。该发明能实现epa与dha较好的分离，但该方法的分离温度在180-220℃左右，易导致dha和epa的氧化；并且该方法要将鱼油先制备成乙酯型，反应成本较高。
[0008]
基于上述结论，开发一种绿色节能，操作简单，成本低廉并且可以同时富集和分离epa和dha的规模生产方法尤为重要。


技术实现要素：

[0009]
本发明提供了一种采用两步酶法乙醇解催化鱼油规模生产高epa乙酯和高dha甘油酯的方法，该方法通过两步酶催化法，可以规模化联产获得高epa乙酯制品和高dha甘油酯制品。
[0010]
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：一种采用两步酶法乙醇解催化鱼油规模生产高epa乙酯和高dha甘油酯的方法，包括以下步骤：1）通过具有脂肪酸选择性脂肪酶cal-a乙醇醇解催化鱼油，得到非epa与dha乙酯和富含epa与dha甘油酯的混合物取鱼油，加入乙醇、cal-a酶和水进行酶的乙醇解催化反应，反应体系中，乙醇和鱼油的质量比为3:1-6:1，酶载量为5-20%，反应体系含水量为5-10%，温度为25-35℃，反应时间为48-60h，反应得到非epa与dha的乙酯和富含epa与dha的甘油酯的混合物；2）正己烷/乙醇双相体系萃取分离非epa与dha的乙酯和富含epa与dha的甘油酯将步骤1）反应所得的乙酯和甘油酯的混合物加入正己烷/乙醇体系中进行萃取，萃取反应条件为：正己烷与乙醇的质量比为0.5:1-1:1，乙醇浓度50-70%，萃取次数2-5次；萃取后非epa与dha的乙酯分布于上层正己烷相，富含epa与dha的甘油酯分布于下层乙醇相，取乙醇相蒸发去除有机溶剂，即可得到富含epa与dha的甘油酯；将富含epa与dha的甘油酯进行甲酯化后，利用气相色谱仪分析脂肪酸组成及其含量，富含epa与dha的甘油酯中的epa和dha含量分别为40-50%和20-30%；
3）通过脂肪酶wkq进一步催化富含epa和dha甘油酯，甘油酯中的epa转化为乙酯，dha以甘油酯的形式保留下来，具体如下：取富含epa与dha的甘油酯，加入脂肪酶wkq、乙醇和水，进行第二次的乙醇醇解反应，反应条件为：乙醇和富含epa和dha的甘油酯的质量比为0.5:1-2:1，酶载量为10-30%，体系含水量为5-15%，温度为25-35℃，反应时间为24-48h；将反应后所得混合物通过正己烷/乙醇双相体系萃取分离高epa乙酯和高dha甘油酯，取上层正己烷相蒸发去除有机溶剂，获得高epa乙酯制品，利用气相色谱仪分析脂肪酸组成及其含量，高epa乙酯制品的epa含量可达70-80%，dha含量低于5%；取下层乙醇相蒸发去除有机溶剂，获得高dha甘油酯制品，将高dha的甘油酯制品进行甲酯化后，利用气相色谱仪分析脂肪酸组成及其含量，高dha甘油酯型制品的dha含量为60-80%，epa含量低于5%。
[0011]
本发明采用以上技术方案，首先通过脂肪酶cal-a酶乙醇醇解催化鱼油，得到非epa与dha的乙酯和富含epa与dha的甘油酯的混合物，接着通过正己烷/乙醇双相体系萃取分离非epa与dha的乙酯和富含epa和dha的甘油酯，最后通过具有非位置特异性的脂肪酶wkq进一步乙醇解催化富含epa和dha的甘油酯，将甘油酯中的epa转化为乙酯，dha以甘油酯的形式保留下来。
[0012]
本发明具有以下优点：经过两步酶法乙醇醇解规模催化鱼油后，获得含量为70-80% epa乙酯（dha含量低于5%）和含量为60-80% dha甘油酯（epa含量低于5%）。这与一步酶催化法相比，本发明所采用的两步酶法可有效地富集并分离鱼油的epa和dha，提高了鱼油epa和dha的应用价值。
具体实施方式
[0013]
本发明所述的脂肪酶cal-a（诺维信，丹麦）和脂肪酶wkq（维克奇生物，中国）为市售产品。
[0014]
实施例 1一种采用两步酶法催化鱼油规模生产高epa乙酯和高dha甘油酯的方法，包括以下步骤：1）通过cal-a酶乙醇醇解催化鱼油，得到非epa与dha的乙酯和富含epa与dha的甘油酯的混合物。
[0015]
取1t鱼油（epa20%，dha8%），加入乙醇、cal-a酶和水进行乙醇醇解反应，置于10t的搅拌式反应器中，反应体系的醇油质量比为4.5:1，酶载量为15%，反应体系含水量为7.5%，温度为30℃，反应时间为55h，反应得到非epa与dha的乙酯和富含epa与dha的甘油酯的混合物；2）正己烷/乙醇双相体系萃取分离非epa与dha额乙酯和富含epa与dha额甘油。
[0016]
将步骤1）反应所得的非epa与dha的乙酯和富含epa与dha的甘油酯的混合物加入正己烷/乙醇体系中进行萃取，萃取反应条件为：正己烷与乙醇的质量比为0.75:1，乙醇浓度60%，萃取次数3次；萃取后非epa与dha的乙酯分布于上层正己烷相，富含epa与dha的甘油酯布于下层乙醇相，取乙醇相蒸发去除有机溶剂，即可得到富含epa和dha的甘油酯；将富含epa与dha的甘油酯进行甲酯化后，利用气相色谱仪分析脂肪酸组成及其含量，甘油酯的epa和dha含量
分别为50%和30%；经过步骤1）、2）最终可获得300kg的富含epa与dha的甘油酯；3）催化富含epa和dha的甘油酯，将甘油酯中的epa转化为乙酯，dha以甘油酯的形式保留下来，具体如下：取步骤2）获得的富含epa和dha的甘油酯，加入脂肪酶wkq、乙醇和水进行第二次的乙醇醇解反应，反应条件如下：乙醇和富含epa和dha的甘油酯的质量比为2:1，脂肪酶wkq酶载量为30%，体系含水量为10%，温度为35℃，反应时间为48h；将反应后所得混合物通过正己烷/乙醇双相体系萃取分离高epa乙酯和高dha甘油酯，取上层正己烷相蒸发去除有机溶剂后可获得120kg的高epa乙酯型产物，经气相色谱仪分析脂肪酸组成及其含量，高epa乙酯型制品的epa含量为80%，dha含量为3%；取下层乙醇相蒸发去除有机溶剂后可获得180kg的高dha甘油酯型产物，将高dha甘油酯进行甲酯化后，利用气相色谱仪分析脂肪酸组成及其含量，高dha甘油酯型制品的dha含量为80%，epa含量为4%。
[0017]
实施例 2一种采用两步酶法乙醇解催化鱼油规模生产高epa乙酯和高dha甘油酯的方法，包括以下步骤：1）通过cal-a酶乙醇醇解催化鱼油，得到非epa与dha的乙酯和富含epa与dha的甘油酯的混合物。
[0018]
取1t鱼油（epa20%，dha8%），加入乙醇、cal-a酶和水进行乙醇醇解反应，置于10t的搅拌式反应器中，反应体系的醇油质量比为3:1，酶载量为5%，反应体系含水量为5%，温度为25℃，反应时间为48h，反应得到非epa与dha的乙酯和富含epa与dha的甘油酯的混合物；2）正己烷/乙醇双相体系萃取分离非epa与dha的乙酯和富含epa与dha的甘油酯将步骤1）反应所得的非epa与dha的乙酯和富含epa与dha的甘油酯的混合物加入正己烷/乙醇体系中进行萃取，萃取反应条件为：正己烷与乙醇的质量比为 0.5:1，乙醇浓度50%，萃取次数2次；萃取后非epa与dha的乙酯分布于上层正己烷相，富含epa与dha的甘油酯分布于下层乙醇相，取乙醇相蒸发去除有机溶剂，即可得到富含epa与dha的甘油酯；将富含epa与dha的甘油酯进行甲酯化后，利用气相色谱仪分析脂肪酸组成及其含量，甘油酯的epa和dha含量分别为40%和20%；经过步骤1）、2）最终可获得280kg的富含epa与dha的甘油酯；3）催化富含epa与dha的甘油酯，将甘油酯中的epa转化为乙酯，dha以甘油酯的形式保留下来，具体如下：取步骤2）获得的富含epa与dha的甘油酯，加入脂肪酶wkq、乙醇和水进行第二次的乙醇醇解反应，酶解反应条件如下：乙醇和富含epa和dha的甘油酯的质量比为0.5:1，脂肪酶wkq酶载量为20%，体系含水量为15%，温度为25℃，反应时间为24h；将反应后所得混合物通过正己烷/乙醇双相体系萃取分离高epa乙酯和高dha甘油酯，取上层正己烷相蒸发去除有机溶剂后可获得105kg的高 epa乙酯型产物，经气相色谱仪分析脂肪酸组成及其含量，高epa乙酯型制品的epa含量为70%，dha含量为4%；取下层乙醇相蒸发去除有机溶剂后可获得175kg的高dha甘油酯型产物，将高dha的甘油酯进行甲酯化后，
利用气相色谱仪分析脂肪酸组成及其含量，高dha甘油酯型制品的dha含量为60%，epa含量为2%。
[0019]
实施例 3采用两步酶法乙醇解催化鱼油规模生产高epa乙酯和高dha甘油酯的方法，包括以下步骤：1）通过cal-a酶乙醇醇解催化鱼油，得到非epa与dha的乙酯和富含epa与dha的甘油酯的混合物。
[0020]
取0.8t鱼油（epa20%，dha8%），加入乙醇、cal-a酶和水进行乙醇醇解反应，置于10t的搅拌式反应器中，反应体系的醇油质量比为6:1，酶载量为20%，反应体系含水量为10%，温度为35℃，反应时间为48h，反应得到非epa与dha的乙酯和富含epa与dha的甘油酯的混合物；2）正己烷/乙醇双相体系萃取分离非epa与dha的乙酯和富含epa与dha的甘油酯将步骤1）反应所得的非epa与dha的乙酯和富含epa与dha额甘油酯的混合物加入正己烷/乙醇体系中进行萃取，萃取反应条件为：正己烷与乙醇的质量比为1:1，乙醇浓度70%，萃取次数5次；萃取后非epa与dha的乙酯分布于上层正己烷相，富含epa与dha的甘油酯分布于下层乙醇相，取乙醇相蒸发去除有机溶剂，即可得到富含epa与dha的甘油酯；将富含epa与dha的甘油酯进行甲酯化后，利用气相色谱仪分析脂肪酸组成及其含量，甘油酯的epa和dha含量分别为45%和25%；经过步骤1）、2）最终可获得202kg的富含epa与dha的甘油酯；3）催化富含epa和dha的甘油酯，将甘油酯中的epa转化为乙酯，将dha以甘油酯的形式保留下来，具体如下：取步骤2）获得的富含epa和dha的甘油酯，加入脂肪酶wkq、乙醇和水进行第二次的乙醇醇解反应，反应条件为：乙醇和富含epa与dha的甘油酯的质量比为2:1，脂肪酶wkq酶载量为10%，体系含水量为5%，温度为30℃，反应时间为36h；将反应后所得混合物通过正己烷/乙醇双相体系萃取分离高epa乙酯和高dha甘油酯，取上层正己烷相蒸发去除有机溶剂后可获得93kg的高 epa乙酯型产物，经气相色谱仪分析脂肪酸组成及其含量，高epa乙酯型制品的epa含量为75%，dha含量为2%；取下层乙醇相蒸发去除有机溶剂后可获得109kg的高dha甘油酯型产物，将高dha的甘油酯进行甲酯化后，利用气相色谱仪分析脂肪酸组成及其含量，高dha甘油酯制品的dha含量为70%，epa含量为4%。
[0021]
以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。