一种可产多种醛类香味物质的泰国肠球菌及其应用的制作方法

1.本发明涉及发酵工程技术领域，尤其涉及一种泰国肠球菌以及使用该泰国肠球菌生产多种醛类香味物质及其它应用。


背景技术：

2.中国白酒的酿造以高粱等谷物为原料，采用大曲、小曲或麸曲等为糖化发酵剂，经过复杂的酶化学反应、生化反应、有机化学反应及微生物代谢活动等发酵过程。原料本身的香味物质、酒曲微生物代谢产物、酒醅蒸馏产生的香气物质及窖泥微生物代谢产生的香气物质，共同形成了白酒复杂多样的风味成分。决定白酒风格和特征的微量成分约占2％，目前已有超过2000种微量成分被检测出来，其中包括醛类、酯类、醇类、杂环类、萜烯类、芳香类、酮类、含氮化合物、酸类、硫类、缩醛类和内酯类。
3.功能菌通常指的是在白酒酿造过程中能够自身直接产生或者间接产生对白酒风味有利作用的微生物。白酒酿造是一个多菌共存的环境，各种微生物为了提高自身的竞争能力，会向环境中释放自身的代谢产物，抑制其他微生物的生长代谢或者使其他的微生物无法利用该物质从而提高自身竞争力，当这些代谢物的量达到一定的量，原料消耗到一定程度，各种微生物的生长就保持相对的数量上的稳定，代谢几乎停止，风味物质基本上成型。
4.不同的微生物菌落构成，就会导致风味物质生产发生差异，这也就造就了各种不同香型的白酒。这些用于酿造的原料、酒曲类型、酿造工艺及生产环境等因素对于白酒的品质风味起着至关重要的影响，影响着不同功能菌的生长代谢，形成特殊的菌落环境，从而形成了独具风格的白酒。
5.肠球菌属(enterococcus)，细胞球形或卵圆形，在液体培养基中呈成对或短链。不生芽孢，革兰氏阳性。有时以鞭毛运动，没有明显的荚膜。兼性厌氧，化能异养，发酵代谢。可发酵的碳水化合物范围广泛，主要产l(+)-乳酸，但不产气，最终ph4.2～4.6，营养需要复杂。通常在10℃到45℃能生长(最适37℃)，在ph9.6、6.5％nacl中和40％胆盐中也能生长。根据肠球菌利用糖类及其分子生物学特征可将肠球菌分为粪肠球菌、屎肠球菌、鸟肠球菌和坚韧肠球菌等。
6.肠球菌为人和动物肠道正常菌群的成员，也是食品中正常菌群的组成部分，因其产酸、水解蛋白或水解脂肪的能力被广泛应用于各类发酵食品中。近年对白酒酿造微生物的研究中发现，肠球菌属对白酒酿造有重要贡献。
7.cn111748504a公开了一种利用白酒糟生产屎肠球菌的技术方法，包括取屎肠球菌冻干菌粉置于改良mrs培养基中，划线培养，挑取3-5个典型屎肠球菌单菌落连续纯化传代复壮3次，选取最优屎肠球菌单菌落，作为一级种子液菌种；无菌操作挑取筛选的屎肠球菌单菌落接种于一级种子培养液中，摇床培养得一级种子液；然后进一步接种到二级种子培养液中培养获得二级种子液；将制备好的二级种子液接种到含有经预处理的白酒糟的固态发酵培养基中，发酵培养；发酵结束后，将发酵产物烘干粉碎得屎肠球菌固态发酵产品。
8.cn114317344a公开了一种屎肠球菌及其应用、组合物，该屎肠球菌可应用于饲料添加剂制备、动物饲料、食品添加剂、食品或益生菌剂等应用，该屎肠球菌的发酵培养方法包括将屎肠球菌的种子液接种于屎肠球菌发酵培养基中，在35℃至40℃和ph为5.8至7.0的条件下发酵培养10h至20h。
9.cn107541407b公开了一种富含γ-氨基丁酸的红曲酒酿造方法，该酿造方法包括在前发酵醪中，加入耐久肠球菌发酵醪液进行后发酵获得成熟红曲酒醪，其中，该耐久肠球菌发酵醪液的制备包括耐久肠球菌种子液制备、耐久肠球菌的载体吸附、耐久肠球菌的活化增殖以及耐久肠球菌的发酵。
10.胡晓龙等(胡晓龙，王康丽，牛广杰，等.基于高通量测序技术的中温大曲中微生物群落多样性解析[j].轻工学报，2019，34(4)：9)采用高通量测序技术对河南省某酒企中温大曲的真菌群落和细菌群落的多样性及其组成进行了研究，结果显示中温大曲曲心中共检测到28个属，其中肠杆菌属、乳杆菌属、乳球菌属、布氏杆菌属、肠球菌属和欧文氏菌属为优势细菌属，除布氏杆菌属外，其他优势细菌属在曲皮和曲心样品中的含量差异较大。
[0011]
麻颖垚等(麻颖垚，胡萍，孙利林，等.宏基因组学分析酱香型白酒窖内发酵优势菌与代谢功能的相关性[j].现代食品科技，2020，36(6)9)采用宏基因组学技术对酱香型白酒第四轮次窖内酒醅的优势菌区系变化、代谢功能差异及其相关性进行分析研究，结果表明发酵30天时优势细菌为乳球菌属(33.83％)、肠球菌属(32.4％)、芽孢杆菌属(14.07％)和分枝杆菌属(8.62％)等。
[0012]
刘正等(刘正，秦培军，卢延想，吴知非，张长霞，李细芬，梁慧珍.酱香型白酒酿造过程中微生物多样性及代谢过程研究进展[j].中国酿造，2022，41(06)：6-11.)研究了酱香型白酒酿造过程中细菌多样性及其代谢过程、酵母菌多样性及其代谢过程、霉菌多样性及其代谢过程研究以及放线菌多样性及其代谢过程，结果显示酵母菌在高温环境无法生存，因此在高温大曲中含量甚微，链格孢霉(alternaria)、黄曲霉、丝衣霉等13种霉菌属是酱香白酒酿造环境中的优势霉菌，放线菌代谢产物对酿酒功能微生物有代谢调控作用，进而影响香气物质产生。
[0013]
江东材等(江东材，朱和琴，罗陟，彭礼群.偏高温大曲发酵过程中物质及微生物区系的研究[j].酿酒，2022，49(04)：53-56.)对柔雅香型白酒生产过程中的偏高温大曲各阶段进行了物质和微生物区系分析，结果表明发酵过程物质变化规律与微生物的繁殖密切相关，代表性的pcr-dgge谱带测序比对相似度
＞
95％细菌主要包括8个属及不可培养的微生物，分别是乳酸菌属、芽孢杆菌属、魏斯氏菌属、葡萄球菌属、片球菌属、明串珠菌属、肠杆菌属和肠球菌属等，其中优势菌是乳酸菌和芽孢杆菌。
[0014]
梁振(梁振.豉香型白酒发酵过程中微生物和风味物质的研究[d].2020)研究了豉香型白酒发酵过程中微生物与风味物质之间的相关性。结果表明，微生物与风味物质之间呈现较好的相关性；与风味物质相关性较强的细菌主要是乳酸杆菌、魏斯氏菌、红球菌、片球菌、肠球菌、乳球菌、明串珠菌，且主要为乳酸菌类。
[0015]
目前的研究多集中于通过高通量测序技术研究例如肠球菌属、肠杆菌属及乳杆菌属等细菌属在白酒酿造过程中的演变规律，然而对具体的肠球菌菌株代谢产物未有相关的研究报道，而寻找一种能够生产多种醛类芳香物质的肠球菌属对于白酒酿酒工艺具有显著意义。
[0016]
此外，一方面由于对本领域技术人员的理解存在差异；另一方面由于申请人做出本发明时研究了大量文献和专利，但篇幅所限并未详细罗列所有的细节与内容，然而这绝非本发明不具备这些现有技术的特征，相反本发明已经具备现有技术的所有特征，而且申请人保留在背景技术中增加相关现有技术之权利。


技术实现要素：

[0017]
针对现有技术之不足，本发明提供了一种可产多种醛类香味物质的泰国肠球菌，该泰国肠球菌具体可产糠醛、癸醛、苯甲醛、苯乙醛等多种醛类香味物质，可应用于各类白酒酿造。
[0018]
优选地，为实现上述目的，本发明提供了一种可产多种醛类香味物质的泰国肠球菌，其名称为泰国肠球菌zqw28(enterococcus thailandicus)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：cgmcc no.25138。
[0019]
优选地，所述泰国肠球菌zqw28基于16s rdna的核苷酸序列如seqid no.1所示。
[0020]
进一步地，扩增引物序列为：
[0021][0022]
优选地，本发明的泰国肠球菌的生物学特征表现为：在mrs琼脂培养基上，菌落微凸呈圆形，乳白色不透明，表面光滑湿润，边缘整齐。
[0023]
优选地，本发明提供了一种前述泰国肠球菌的筛选鉴定方法，所述筛选鉴定方法包括如下步骤：将泸州老窖窖泥样品经过打散分离、划线纯化、菌种保藏后，以产醛类风味物质的能力作为筛选标准，获得产醛类风味物质的泰国肠球菌。
[0024]
优选地，打散分离包括：泸州老窖窖泥样品在经振荡被打散后取悬液稀释，在固体培养基平板上涂布多个梯度的稀释液，以进行厌氧培养。
[0025]
优选地，划线纯化包括：在长出菌落的平板上挑取不同菌落形态的单菌落，通过二次划线纯化出所有单菌落。
[0026]
优选地，菌种保藏包括：纯化后的每种菌株以单菌落的形式在液体培养基中厌氧培养。
[0027]
优选地，本发明提供一种筛选方法，用于对经分离纯化后的各菌株进行产目的化合物的能力检测，以筛选出具有高产能力的菌株。具体而言，该筛选方法包括将分离纯化后得到的菌株甘油保存管溶解，分别将其接种于mrs液体培养基中，并于37℃厌氧条件下静置培养20h，活化三代后按2％接种量接入50ml的mrs液体培养基中培养20h，发酵结束后得到待测的发酵菌液。此后，利用顶空固相微萃取法将目的化合物萃取并富集，再由gc-ms来进行色谱检测分析，以通过对比挥发性物质的含量来筛选得到具有高产醛类风味物质能力的泰国肠球菌。
[0028]
优选地，本发明提供一种针对产有机酸、有机醇和酯类化合物细菌的分子鉴定方法，具体包括对目标菌株进行扩培，取对数生长期新鲜菌液，离心收集菌体，采用细菌基因组抽提试剂盒提取基因组dna。特别地，本发明中，采用乳酸菌通用引物27f/1492r扩增目标菌株的16srdna全长序列。
[0029]
优选地，本发明还提供一种微生物菌剂，该微生物菌剂含有泰国肠球菌。
[0030]
优选地，微生物菌剂为含有泰国肠球菌活细胞、冷冻干燥得到的泰国肠球菌干菌体、固定化的泰国肠球菌细胞中的一种或多种的液体菌剂或固体菌剂。
[0031]
优选地，本发明提供一种冻干菌粉，该冻干菌粉按如下方法制备：将泰国肠球菌活化后，接种于培养基中富集培养，培养结束后离心收集菌体，向其添加海藻糖、山梨醇、脱脂乳粉作为冻干保护剂，混合均匀后进行真空冷冻干燥，获得冻干菌粉。
[0032]
优选地，本发明提供一种泰国肠球菌，或含有泰国肠球菌的微生物菌剂，或含有泰国肠球菌的冻干菌粉在发酵生产醛类香味物质中的应用。
[0033]
优选地，泰国肠球菌在发酵生产醛类香味物质中的应用可以是将泰国肠球菌，或含有泰国肠球菌的微生物菌剂，或含有泰国肠球菌的冻干菌粉在发酵培养基中静置培养。具体地，培养基包括mrs液体培养基、mrs固体培养基和发酵培养基。
[0034]
优选地，本发明中，发酵培养基的组成为每升培养基中含有16g葡萄糖，10g胰蛋白胨，2.5g酵母粉，5g牛肉膏，3.85g牛脑，4.9g牛心，0.5g吐温80，1g柠檬酸铵，2.5g氯化钠，2.5g无水乙酸钠，0.05g硫酸镁，0.025g硫酸锰，1.25g磷酸氢二钠和1g磷酸氢二钾。
[0035]
优选地，泰国肠球菌在生产多种醛类香味物质中的应用具体可以是将该泰国肠球菌在发酵培养基中，37℃静置培养24h，ph值为7.0，其中，该泰国肠球菌的接种量为2％(
×
107cfu/ml)。
[0036]
更具体地，该泰国肠球菌株可产糠醛、癸醛、苯甲醛、苯乙醛、3，4-二甲基苯甲醛、2，3-二氢-2，2，6-三甲基苯甲醛，其中，糠醛、癸醛、苯甲醛、苯乙醛、3，4-二甲基苯甲醛、2，3-二氢-2，2，6-三甲基苯甲醛的含量分别为0.356、0.322、0.352、0.161、0.321、1.196mg/l。
[0037]
优选地，本发明中，醛类香味物质选自由糠醛、癸醛、苯甲醛、苯乙醛、3，4-二甲基苯甲醛、2，3-二氢-2，2，6-三甲基苯甲醛组成的组。特别地，由泰国肠球菌产出的醛类香味物质中，2，3-二氢-2，2，6-三甲基苯甲醛的浓度/含量最高，苯乙醛的浓度/含量最低。也即，木香、辛香、药香、粉香特征更显著。
[0038]
优选地，本发明提供一种泰国肠球菌，或含有泰国肠球菌的微生物菌剂，或含有泰国肠球菌的冻干菌粉在酿酒发酵中的应用。
[0039]
优选地，泰国肠球菌在酿酒发酵中的应用可以是将泰国肠球菌，或含有泰国肠球菌的微生物菌剂，或含有泰国肠球菌的冻干菌粉加入至酒窖窖泥中。特别地，将泰国肠球菌，或含有泰国肠球菌的微生物菌剂，或含有泰国肠球菌的冻干菌粉加入酒窖窖泥中进行发酵，以使酒样含有醛类香味物质，提高酒品风味。
[0040]
优选地，本发明提供一种泰国肠球菌，或含有泰国肠球菌的微生物菌剂，或含有泰国肠球菌的冻干菌粉在白酒酿造中的应用。
[0041]
优选地，泰国肠球菌在白酒酿造中的应用可以是将泰国肠球菌，或含有泰国肠球菌的微生物菌剂，或含有泰国肠球菌的冻干菌粉在白酒发酵过程中添加。
[0042]
优选地，本发明还提供一种白酒，该白酒可以通过在白酒发酵过程中添加泰国肠球菌，或含有泰国肠球菌的微生物菌剂，或含有泰国肠球菌的冻干菌剂获得。特别地，在白酒酿造过程中添加泰国肠球菌，使白酒酒样富含醛类香味物质，从而提高酒品风味。
[0043]
本发明的有益技术效果包括：本发明提供的泰国肠球菌zqw28可产多种醛类香味物质，对研究白酒酿造过程微生物及风味物质来源具有重要意义。本发明提供的泰国肠球
菌zqw28可为白酒酿造工艺优化提供菌种资源，具有较为广阔的市场应用前景。
[0044]
生物保藏说明
[0045]
本发明提供的泰国肠球菌zqw28(enterococcus thailandicus)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：cgmcc no.25138，保藏日期为2022年6月21日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
具体实施方式
[0046]
本发明提供了一种可产多种醛类香味物质的泰国肠球菌，其名称为泰国肠球菌zqw28(enterococcus thailandicus)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：cgmcc no.25138，保藏日期为2022年6月21日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编100101。
[0047]
实施例1
[0048]
根据一种优选实施方式，本实施例提供了一种泰国肠球菌zqw28(enterococcus thailandicus)在生产多种醛类香味物质中的应用。进一步地，该应用具体包括将泰国肠球菌zqw28在培养基中，37℃静置培养24h，ph值为7.0，其中，该泰国肠球菌zqw28(enterococcus thailandicus)的接种量为2％(
×
107cfu/ml)。特别地，培养基包括mrs液体培养基、mrs固体培养基和发酵培养基。
[0049]
具体地，本实施例中，mrs液体培养基的具体组成为葡萄糖20g/l，蛋白胨10g/l，酵母粉4g/l，牛肉浸粉5g/l，吐温80 1g/l，柠檬酸三铵2g/l，醋酸钠5g/l，硫酸镁0.2g/l，硫酸锰0.05g/l以及磷酸氢二钾1g/l。特别地，mrs液体培养基的ph为7.0，并且该mrs液体培养基需在115℃下高压蒸汽灭菌20分钟。
[0050]
根据一种优选实施方式，本实施例中，mrs固体培养基的具体组成为在mrs液体培养基的基础上添加15g/l的琼脂。特别地，mrs固体培养基需在115℃下高压蒸汽灭菌20分钟。
[0051]
更具体地，发酵培养基的具体组成为葡萄糖16g/l，胰蛋白胨10g/l，酵母粉2.5g/l，牛肉膏5g/l，牛脑3.85g/l，牛心4.9g/l，吐温80 0.5g/l，柠檬酸铵1g/l，氯化钠2.5g/l，无水乙酸钠2.5g/l，硫酸镁0.05g/l，硫酸锰0.025g/l，磷酸氢二钠1.25g/l，磷酸氢二钾1g/l。特别地，发酵培养基的ph为7.0，且发酵培养基需在115℃下高压蒸汽灭菌20分钟。
[0052]
根据一种优选实施方式，本发明提供的泰国肠球菌zqw28(enterococcus thailandicus)可应用至白酒酿造。具体地，可在白酒酿造发酵过程中添加本发明的泰国肠球菌zqw28(enterococcus thailandicus)，或是添加含有泰国肠球菌zqw28(enterococcus thailandicus)活细胞、冷冻干燥得到的泰国肠球菌zqw28(enterococcus thailandicus)干菌体、固定化的泰国肠球菌zqw28(enterococcus thailandicus)细胞中的一种或多种的液体菌剂或固体菌剂。
[0053]
根据一种优选实施方式，本实施例还提供一种含有泰国肠球菌zqw28(enterococcus thailandicus)的冻干菌粉。具体地，含有泰国肠球菌zqw28(enterococcus thailandicus)的冻干菌粉的制备方法如下：将本实施例所述的泰国肠球菌zqw28(enterococcus thailandicus)活化后，接种于培养基中富集培养，培养结束后离心收集菌体，向其添加海藻糖、山梨醇、脱脂乳粉作为冻干保护剂，混合均匀后进行真空冷冻干燥，获
得冻干菌粉。
[0054]
实施例2
[0055]
根据一种优选实施方式，本实施例是对实施例1的进一步改进，重复的内容不再赘述。
[0056]
根据一种优选实施方式，本发明中的泰国肠球菌zqw28(enterococcus thailandicus)具体可通过如下方法获得：
[0057]
s2.1分离：窖泥样品在经振荡被打散后取悬液稀释，在固体培养基平板上涂布多个梯度的稀释液，以进行厌氧培养。
[0058]
具体而言，取20g泸州老窖窖泥样品，放入装有180ml无菌蒸馏水的锥形瓶中，恒温摇床振荡10min将样品充分打散、混匀。取1ml样品悬液，采用倍比稀释法，稀释至10-2
～10-7
，从每个梯度的稀释液中吸取100μl，均匀涂布于mrs固体培养基平板上，平行制备两块平板，倒置，放于37℃厌氧下培养36～48h，并及时观察。
[0059]
s2.2纯化：将长出菌落的平板取出，挑取不同菌落形态的单菌落，进行二次划线，直至纯化出所有单菌落。
[0060]
s2.3保藏：纯化后的每种菌株以单菌落的形式在液体培养基中厌氧培养。
[0061]
具体而言，将纯化完成后的每种菌株的单菌落挑入5mlmrs液体培养基中，置于37℃厌氧下静置培养20～24h，吸取1ml菌液至保菌管中，加入0.5ml60％的无菌甘油溶液，重悬，置于-80℃保存。
[0062]
实施例3
[0063]
本实施例是对实施例1和/或实施例2的进一步改进，重复的内容不再赘述。
[0064]
根据一种优选实施方式，本实施例提供了一种筛选方法，该筛选方法可以对经分离纯化后保藏于甘油保存管中的各菌株进行产目的化合物的能力检测，以筛选出具有高产能力的菌株，其中，在本实施例中目的化合物为多种醛类物质。具体地，本实施例中，醛类物质包括糠醛、癸醛、苯甲醛、苯乙醛。进一步地，醛类物质选自由糠醛、癸醛、苯甲醛、苯乙醛、3，4-二甲基苯甲醛、2，3-二氢-2，2，6-三甲基苯甲醛组成的组。
[0065]
根据一种优选实施方式，通过检测各菌株产醛类物质的含量可以筛选得到一株具有高产醛类物质能力的菌株。具体而言，该筛选方法具体包括：
[0066]
s3.1、准备待测菌液
[0067]
具体而言，将分离纯化后得到的菌株甘油保存管溶解，分别将其接种于mrs液体培养基中，并于37℃厌氧条件下静置培养20h，活化三代后按2％(体积比)接种量接入50ml的mrs液体培养基中培养20h。发酵结束后得到待测的发酵菌液。
[0068]
s3.2定性检测醛类物质
[0069]
优选地，待测的发酵菌液利用顶空固相微萃取法将目的化合物萃取并富集，再由gc-ms来进行色谱检测分析。
[0070]
具体而言，对菌液进行离心处理，取上清液，加入顶空瓶中，加入饱和nacl溶液，将制备好的样品于60℃保温平衡5min后，用50/30μmdvb/car/pdms萃取头在60℃萃取40min，萃取结束后在gc进样口250℃解吸5min。化合物检索结果与nist标准谱库进行匹配，相似度达到80％以上确认为目的化合物。以未添加菌发酵的培养液为空白对照组，定性分析各挥发性物质。
[0071]
特别地，gc-ms检测色谱的操作条件为：
[0072]
气相色谱条件：hp-innowax色谱柱(60m
×
0.25mm
×
0.25μm)；升温程序：起始温度40℃，保持5min，以4℃/min升到100℃，再以6℃/min升至230℃，保持10min，载气为高纯氦气(1.0ml/min)；进样口温度250℃，不分流。
[0073]
质谱条件：电子电离源，电子能量70ev；电子倍增器电压350v；离子源温度230℃；传输线温度250℃；质量范围40-450m/z。
[0074]
根据一种优选实施方式，通过以上述方法，在分离得到的菌株中获得一株具有较强产醛类化合物能力的菌株，选择该菌株做进一步研究。
[0075]
特别地，上述筛选方式可作为微生物产醛类物质的能力检测方式。
[0076]
根据一种优选实施方式，在本发明中“顶空固相微萃取”可以为以顶空方式进样的固相微萃取技术，其中，顶空作为一种进样方式，其可以将待测样本置于一恒温密闭容器中，通过加热升温使得挥发性组分从样本中挥发出来，在顶空瓶里面两相中达到热力学平衡之后，直接抽提顶部气体打入气相色谱-质谱联用仪中进行分离分析，从而进行一些挥发性或者气味物质的检测；而固相微萃取技术的作用为在抽提气体样本时采用涂有固定相的熔融石英纤维来吸附和富集，然后再进行解析进样。
[0077]
根据一种优选实施方式，在本发明中“gc-ms”可以为气相色谱-质谱联用仪，其是一种结合气相色谱和质谱的特性，在试样中鉴别不同物质的装置。当多组分的混合样品进入色谱柱后，由于吸附剂对每个组分的吸附力不同，经过一定时间后，各组分在色谱柱中的运行速度也就不同。吸附力弱的组分容易被解吸下来，最先离开色谱柱进入检测器，而吸附力最强的组分最不容易被解吸下来，因此最后离开色谱柱。如此，各组分得以在色谱柱中彼此分离，顺序进入检测器中被检测、记录下来。
[0078]
实施例4
[0079]
本实施例是对实施例1、实施例2和/或实施例3的进一步改进，重复的内容不再赘述。
[0080]
根据一种优选实施方式，本实施例提供一种针对产有机酸、有机醇和酯类化合物细菌的分子鉴定方法，该鉴定方法可用于确定筛选后的菌株的种属信息。具体地，该鉴定方法可以包括：
[0081]
对目标菌株进行扩培，取对数生长期新鲜菌液，离心收集菌体，采用细菌基因组抽提试剂盒提取基因组dna。
[0082]
根据一种优选实施方式，采用乳酸菌通用引物27f/1492r扩增其16srdna全长序列，具体如下：
[0083][0084]
①
反应体系(50μl)
[0085][0086]
②
反应程序
[0087][0088]
特别地，变性、退火以及延伸步骤优选重复35个循环。
[0089]
根据一种优选实施方式，pcr产物用1.0％的琼脂糖凝胶电泳分离检验，电压约11v/cm，电泳时间20min。特别地，pcr产物的检测方法还包括聚丙烯酰胺凝胶电泳法。进一步地，常用的pcr产物的纯化方法包括硅胶层析柱法、磁珠法、渗透液结合醇沉纯化法、直接沉淀纯化及凝胶回收纯化等。
[0090]
根据一种优选实施方式，pcr产物的测序常采用循环测序法，即在pcr反应体系中同时将双脱氧核苷三磷酸(ddntp)加入，并利用核素或荧光素标记的引物引导扩增，使模板的扩增与测序同时进行。
[0091]
根据一种优选实施方式，测序获得16s rdna片段的基因序列通过ncbi(national center for biotechnology information)的blast(basic local alignment search tool)比对，确定菌株种属信息，鉴定其为泰国肠球菌，并命名为泰国肠球菌zqw28(enterococcus thailandicus)。
[0092]
实施例5
[0093]
本实施例是对实施例1、实施例2、实施例3和/或实施例4的进一步改进，重复的内容不再赘述。
[0094]
根据一种优选实施方式，本实施例提供了针对通过泰国肠球菌zqw28(enterococcus thailandicus)产多种醛类香味物质的检测方法。具体而言，该检测方法包括：
[0095]
将泰国肠球菌zqw28(enterococcus thailandicus)甘油保存管溶解后接种于mrs液体培养基中，并于37℃厌氧下静置培养24h，活化三代后按2％(体积比)接种量接入50ml发酵培养基中进行培养24h。进一步地，发酵结束后得到菌液，10000rpm离心5min后取上清。检测方法同实施例3中的gc-ms检测方法，以0.822mg/ml的2-辛醇为内标物，以原始培养基为空白对照，计算各挥发性物质的含量。
[0096]
根据一种优选实施方式，醛类香味物质的检测结果如表1所示，可产糠醛、癸醛、苯甲醛、苯乙醛、3，4-二甲基苯甲醛和2，3-二氢-2，2，6-三甲基苯甲醛，并且各自对应的含量分别为0.356、0.322、0.352、0.161、0.321、1.196mg/l。
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表1泰国肠球菌zqw28发酵液中醛类香味物质的检测结果
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结果表明，泰国肠球菌zqw28(enterococcus thailandicus)发酵液中，2，3-二氢-2，2，6-三甲基苯甲醛在泰国肠球菌zqw28(enterococcus thailandicus)发酵液中所占浓度/含量最高，糠醛、苯甲醛在泰国肠球菌zqw28(enterococcus thailandicus)发酵液中所占浓度/含量相当，癸醛、苯乙醛在泰国肠球菌zqw28(enterococcus thailandicus)发酵液中所占浓度/含量相当且略低于糠醛、苯甲醛浓度占比，以及苯乙醛在泰国肠球菌zqw28(enterococcus thailandicus)发酵液中所占浓度/含量最低。
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需要注意的是，上述具体实施例是示例性的，本领域技术人员可以在本发明公开内容的启发下想出各种解决方案，而这些解决方案也都属于本发明的公开范围并落入本发明的保护范围之内。本领域技术人员应该明白，本发明说明书为说明性而并非构成对权利要求的限制。本发明的保护范围由权利要求及其等同物限定。本发明说明书包含多项发明构思，诸如“优选地”、“根据一个优选实施方式”或“可选地”均表示相应段落公开了一个独立的构思，申请人保留根据每项发明构思提出分案申请的权利。