本发明涉及细胞冻存复苏，尤其涉及一种干细胞的冻存复苏方法。
背景技术：
1、冷冻保存是将细胞、组织及器官等生物样品置于超低温环境中，大大降低其新陈代谢速率以实现长期存储，并能在解冻后恢复生物样品功能的科学与技术。由于在培养液中保存、运输的干细胞保质期极短，而冷冻保存可以减少细胞传代培养的复杂工序以及培养液等材料的消耗，防止干细胞由于传代次数过多而变异乃至死亡。因此，冷冻保存技术对干细胞的大规模生产以及应用有着极其重要的意义。由于冷冻保存是在超低温下进行的，会使干细胞的活性受到一定程度的影响，导致复苏率下降。为了改善干细胞解冻复苏后的复苏率，有必要对干细胞的冻存复苏方法进行优化，开发一种能够使干细胞保持高冻存复苏率的冻存复苏方法。
技术实现思路
1、基于背景技术存在的技术问题，本发明提出了一种干细胞的冻存复苏方法。
2、本发明提出的一种干细胞的冻存复苏方法，包括以下步骤：
3、s1、将干细胞悬液离心后，加入冻存液a重悬至一定的细胞浓度，然后转移至冻存管中，先在4℃下预冷一段时间，然后降温至-80～-75℃，放置一段时间，再转移至液氮中冻存；
4、所述冻存液a由以下组分组成：二甲基亚砜20～30g/l、甘油40～60g/l、乙二醇20～40g/l、海藻糖10～20g/l、人血清白蛋白3～8g/l、苯丙氨酸接枝羧甲基-β-环糊精15～25g/l、抗坏血酸5～10g/l、余量为dmem/f12培养基；
5、s2、将冻存一段时间的干细胞从液氮中取出，在37℃水浴下解冻；
6、s3、向解冻后的干细胞悬液中加入复苏液b，离心后加入复苏液c重悬，离心后用dmem/f12培养基重悬，即可；
7、所述复苏液b由以下组分组成：甘油30～40g/l、乙二醇10～20g/l、海藻糖5～10g/l、人血清白蛋白2～3g/l、抗坏血酸5～10g/l、l-谷氨酰胺0.1～0.3mg/l、人表皮生长因子10～20μg/l、余量为dmem/f12培养基；
8、所述复苏液c由以下组分组成：甘油10～20g/l、乙二醇3～5g/l、海藻糖3～5g/l、人血清白蛋白1～2g/l、抗坏血酸5～10g/l、l-谷氨酰胺0.1～0.3mg/l、人表皮生长因子10～20μg/l、余量为dmem/f12培养基。
9、优选地，所述苯丙氨酸接枝羧甲基-β-环糊精的制备方法为：向羧甲基-β-环糊精的水溶液中加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐、1-羟基苯并三唑，搅拌反应1～2h，然后加入l-苯丙氨酸，搅拌反应20～30h，将得到的产物透析、冷冻干燥，即得。
10、优选地，所述羧甲基-β-环糊精、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐、1-羟基苯并三唑、l-苯丙氨酸的质量比为1：(0.5～1.5)：(0.5～1.5)：(1～1.5)。
11、优选地，s1中，加入冻存液a重悬至细胞浓度为2～6×106个/ml。
12、优选地，s1中，先在4℃下预冷20～30min，然后降温至-80～-75℃，放置8～12h，然后转移至液氮中冻存。
13、优选地，s2中，在37℃水浴下解冻1～3min。
14、优选地，s3中，加入复苏液b的体积为干细胞悬液体积的5～8倍。
15、优选地，s3中，加入复苏液c的体积为干细胞悬液体积的5～8倍。
16、本发明的有益效果如下：
17、本发明的干细胞冻存复苏方法，其在冻存时采用冻存液a，其组分中含以环糊精为核心表面接枝苯丙氨酸的苯丙氨酸接枝羧甲基-β-环糊精，既可以增加空间位阻从而阻止冰晶生长，且其表面接枝的苯基可以通过疏水作用抑制冰晶成核，通过这种协同作用可以达到控冰的目的，有效抑制冰晶对干细胞的损伤，从而在显著降低dmso含量的前提下起到很好的冷冻保护效果，同时，由于该冻存液a中dmso含量低、无动物血清，毒性低，能够减少dmso在冻存和复苏过程中对干细胞产生的损害，有效改善干细胞的冻存复苏存活率；在复苏时依次采用复苏液b、复苏液c对解冻后的干细胞进行处理，复苏液b、复苏液c中含有适量促进干细胞活性的组分，且形成了一定的浓度梯度，有助于干细胞在合适的外界环境中恢复活性，从而提高干细胞的冻存复苏存活率。因此，本发明的干细胞冻存复苏方法能够有效减少冻存和复苏过程中干细胞受到的损害，复苏存活率高。
1.一种干细胞的冻存复苏方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的干细胞的冻存复苏方法，其特征在于，所述苯丙氨酸接枝羧甲基-β-环糊精的制备方法为：向羧甲基-β-环糊精的水溶液中加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐、1-羟基苯并三唑，搅拌反应1～2h，然后加入l-苯丙氨酸，搅拌反应20～30h，将得到的产物透析、冷冻干燥，即得。
3.根据权利要求2所述的干细胞的冻存复苏方法，其特征在于，所述羧甲基-β-环糊精、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐、1-羟基苯并三唑、l-苯丙氨酸的质量比为1：(0.5～.5)：(0.5～1.5)：(1～1.5)。
4.根据权利要求1所述的干细胞的冻存复苏方法，其特征在于，s1中，加入冻存液a重悬至细胞浓度为2～6×106个/ml。
5.根据权利要求1所述的干细胞的冻存复苏方法，其特征在于，s1中，先在4℃下预冷20～30min，然后降温至-80～-75℃，放置8～12h，然后转移至液氮中冻存。
6.根据权利要求1所述的干细胞的冻存复苏方法，其特征在于，s2中，在37℃水浴下解冻1～3min。
7.根据权利要求1所述的干细胞的冻存复苏方法，其特征在于，s3中，加入复苏液b的体积为干细胞悬液体积的5～8倍。
8.根据权利要求1所述的干细胞的冻存复苏方法，其特征在于，s3中，加入复苏液c的体积为干细胞悬液体积的5～8倍。