一种登革热病毒核酸检测引物探针组合物及一体化微流控芯片试剂盒的制作方法

本发明属于生物检测，具体涉及一种登革热病毒核酸检测引物探针组合物及一体化微流控芯片试剂盒。

背景技术：

1、登革热是一种由登革热病毒引起的蚊子传播的热带疾病症状，通常在感染后3至14天出现症状，可能包括高烧、头痛、呕吐、肌肉和关节疼痛，以及特征性的皮疹。在一小部分病例中，该病发展为更严重的登革出血热，导致出血、低水平的血小板和血浆泄漏，或发展为登革休克综合征，出现危险的低血压。

2、登革热病毒(denv)是黄病毒科黄病毒属的一种rna病毒。登革病毒基因组大约11kb，它们编码形成病毒颗粒的三种不同类型的结构蛋白质分子(c、prm和e)和其他7种非结构蛋白质分子(ns1、ns2a、ns2b、ns3、ns4a、ns4b、ns5)。

3、登革热病毒的检测方法包括酶联免疫吸附试验(elisa)和常规pcr。然而，elisa是一个多步骤的过程，常规pcr的污染和假阳性结果的风险增加。实时荧光定量pcr技术是目前应用最广泛的分子检测法，具有在短时间内提供灵敏、准确的结果的优点。该技术不仅实现了对病毒核酸的定性和定量，而且具有灵敏度高、特异性强、自动化程度高等特点。例如，专利wo2016078553a1提供了一种反转录pcr检测和分型登革病毒的试剂盒及其检测方法，可以检测到包括血液在内的各种样品中登革病毒的核酸并且确定感染的登革病毒的血清型。

4、对于病毒的核酸检测，现有检测系统或方法通常需要在检测前进行样品处理提取核酸，本技术人基于该问题，经过数年研发，与在先申请cn202110057507.0中公开了一种新型现场化快速核酸检测设备carryon p1000q，该设备为“手持全自动封闭式核酸qpcr分析系统”，可在60分钟内完成新冠病毒的现场自动化核酸检测，能够实现“样品进，结果出”的快速检测。本技术即在该技术的基础上，进一步研发出的，能够更好的配合该设备的试剂类发明，即登革热病毒检测的一体化微流控芯片试剂盒，该试剂盒在一体化芯片上进行样本的核酸提取、纯化、扩增和检测，实现了快速的poct检测。

5、现有的检测试剂盒及方法较操作时间长，且操作步骤繁琐，因此，亟需提供一种灵敏度高、特异性强、覆盖面广、操作简便、省时且节约成本的登革热病毒核酸检测试剂盒及其使用方法。

技术实现思路

1、为了解决现有技术中的上述问题，本技术提供了一种登革热检测的引物探针组合物及一体化微流控芯片试剂盒。采用本发明所述的引物探针组合物及一体化微流控芯片试剂盒检测登革热，集成了核酸提取、纯化、扩增和检测，具有较好的灵敏度和准确度，扩增效率高，且操作简便，快速省时。

2、为了实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：

3、一方面，本发明提供了一种检测登革热的引物探针组合物，所述的引物探针组合物包括检测登革热病毒的引物探针组合物和检测内参的引物探针组合物。

4、具体地，所述的检测登革热病毒的引物探针组合物为denv引物探针组合物；

5、具体地，所述的检测内参的引物探针组合物为ipc引物探针组合物。

6、进一步具体地，

7、(1)所述的denv引物探针组合物为：

8、denv-f(seq id no:1)：5'-aaggactagaggttagaggaga-3'；

9、denv-r(seq id no:2)：5'-ctggawtgatgytgargaga-3'；

10、denv-p(seq id no:3)：5'-aggatctctggtctctcccagcgt-3'；

11、(2)所述的ipc引物探针组合物为：

12、f(seq id no:4)：5'-agttgcagtgtaaccgtcatgta-3'；

13、r(seq id no:5)：5'-tcgacgagactctgctgttaa-3'；

14、p(seq id no:6)：5'-cagtaatctgcgtcgcacgtgtgca-3'。

15、具体地，所述的登革热的引物探针组合物用于检测登革热病毒的3'noncoding片段。

16、具体地，所述探针的5'端标记有荧光报告基团，所述探针的3'端标记有淬灭基团；所述荧光报告基团为cy3、cy5、cy5.5、fam、hex、vic、joe或rox中的一种或多种，所述淬灭基团为荧光淬灭基团。

17、进一步具体地，所述的检测内参ipc的探针用cy5标记。

18、另一方面，本发明提供了上述引物探针组合物在制备检测登革热产品中的应用。

19、具体地，所述的产品包括但不限于独立试剂、芯片或试剂盒。

20、又一方面，本发明提供了一种检测登革热的产品，所述的产品包括上述引物探针组合物。

21、具体地，所述的产品包括但不限于独立试剂、芯片或试剂盒。

22、具体地，所述的产品还包括纯化试剂、风干rt-qpcr反应试剂和冻干ipc质控品。

23、进一步具体地，所述的纯化试剂包括裂解液、洗脱液和磁珠，所述的裂解液包括盐酸胍、醋酸钠和triton x-100，所述的洗脱液包括tris-hcl，所述的裂解液和洗脱液的体积比为1:2-2.5，所述的磁珠为干化磁珠。

24、进一步具体地，所述的裂解液包括6m盐酸胍、0.4m醋酸钠(ph4.7)和2％triton x-100，所述的洗脱液包括10mm tris-hcl(ph8.5)。

25、进一步具体地，所述的冻干ipc过程质控品的序列为seq id no:7。

26、进一步具体地，所述的冻干ipc过程质控品是rna假病毒。

27、进一步具体地，所述的冻干ipc过程质控品的冻干体系包括甘露醇、海藻糖、牛血清白蛋白、消泡剂、2-羟丙基-β-环糊精、tris-hcl(ph 8.0)、nacl、tween20。

28、进一步具体地，所述的冻干ipc过程质控品以冻干球的形式封装在一体化微流控芯片中。

29、又一方面，本发明还提供了一种检测登革热的微流控芯片试剂盒，所述的试剂盒包括上述引物探针组合物。

30、具体地，所述的试剂盒还包括纯化试剂、风干rt-qpcr反应试剂和冻干ipc质控品。

31、进一步具体地，所述的纯化试剂包括裂解液、洗脱液和磁珠，所述的裂解液包括盐酸胍、醋酸钠和triton x-100，所述的洗脱液包括tris-hcl，所述的裂解液和洗脱液的体积比为1:2-2.5，所述的磁珠为干化磁珠。

32、进一步具体地，所述的裂解液包括6m盐酸胍、0.4m醋酸钠(ph 4.7)和2％tritonx-100，所述的洗脱液包括10mm tris-hcl(ph8.5)。

33、进一步具体地，所述的冻干ipc过程质控品的序列为seq id no:7。

34、进一步具体地，所述的冻干ipc过程质控品是rna假病毒。

35、进一步具体地，所述的冻干ipc过程质控品的冻干体系包括甘露醇、海藻糖、牛血清白蛋白、消泡剂、2-羟丙基-β-环糊精、tris-hcl(ph 8.0)、nacl、tween20。

36、进一步具体地，所述的冻干ipc过程质控品以冻干球的形式封装在一体化微流控芯片中。

37、具体地，所述的试剂盒在一体化芯片上完成样本的核酸提取、纯化、扩增和检测。

38、具体地，所述的微流控芯片试剂盒可用于carryon p1000q快速核酸检测设备。

39、又一方面，本发明提供了上述引物探针组合物、产品或试剂盒在检测登革热病毒中的应用。

40、又一方面，本发明提供了一种检测登革热病毒的方法，所述的方法为非疾病诊断和治疗方法，所述的方法包括利用上述引物探针组合物、产品或试剂盒对待测样本中登革热病毒进行检测。

41、具体地，所述的方法包括以下步骤：

42、(1)提取样本的rna并采用上述纯化试剂进行纯化；

43、(2)利用上述引物探针组合物扩增步骤(1)提取并纯化的样本rna；

44、(3)对扩增结果进行分析。

45、进一步具体地，上述步骤采用carryon p1000q快速核酸检测设备，在微流控一体化芯片上进行。

46、与现有技术相比，本发明提供的试剂盒具有如下有益效果：

47、(1)采用本发明提供的引物探针组合物同时检测登革热，具有较好的灵敏度和准确度，扩增效率高，且操作简便，快速省时。

48、(2)利用一体化芯片上微流控的方式解决病原体快速检测的问题，实现“样本进-结果出”的poct检测方案，取样后直接加入设备，集成核酸的提取、纯化、扩增和检测，60分钟内出结果。