本发明属于生物，尤其是涉及单萜合酶、基因工程菌株及其应用。
背景技术：
1、单萜类化合物是分子中含有两分子异戊二烯单位的萜烯及其衍生物。按其结构分类包括：无环单萜，单环单萜，多环单萜。桉叶素（1，8-cineol）是一种单萜烯氧化物，是桉树精油的主要成分。因其药用价值及其在食品、化妆品、能源工业中存在的巨大应用潜力，吸引了广泛关注。
2、目前，单萜类化合物主要通过从天然植物中提取或者化学合成得到，但是这些方法产率低，高度依赖原料的可利用性。同时，产生的废弃物成分复杂，污染环境，给后续处理带来困难。随着合成生物学技术和代谢工程的发展，改造微生物使其成为高附加值化学品合成的细胞工厂，为萜类化合物的合成开辟了绿色清洁生产的新途径。
3、单萜合酶是影响萜类物质生物合成的关键因素之一。当前挖掘的单萜合酶催化活性低，使单萜微生物合成的应用受到限制（leferink ngh, jervis aj, zebec z, toogoodhs, hay s, takano e, scrutton ns. a 'plug and play' platform for theproduction of diverse monoterpene hydrocarbon scaffolds in escherichia coli.chemistryselect. 2016 jun 21;1(9):1893-1896. doi: 10.1002/slct.201600563.pmid: 29756025; pmcid: pmc5947754.；lei d, qiu z, qiao j, zhao gr. plasticityengineering of plant monoterpene synthases and application for microbialproduction of monoterpenoids. biotechnol biofuels. 2021 jun 30;14(1):147.doi: 10.1186/s13068-021-01998-8. pmid: 34193244; pmcid: pmc8247113.）。
4、因此，优良单萜合酶的挖掘与获得将对推进单萜生物合成具有重要意义。
技术实现思路
1、本发明提供单萜合酶，以及利用该酶生产桉叶素的应用。
2、本发明的一个目的在于提供单萜合酶。
3、本发明的第一方面涉及单萜合酶，其含有选自如下所示的氨基酸序列之一：
4、a)seq id no：10至seq id no：13；
5、b)与a)中所示序列具有至少70％同一性，优选至少80％同一性，至少90％同一性，至少95％同一性，更优选至少99%同一性，仍然具有所述功能。
6、本发明还提供编码上述单萜合酶的核酸。
7、本发明还提供表达上述单萜合酶的基因工程菌，其包含编码所述单萜合酶的核酸。
8、根据本发明的实施方案，所述基因工程菌是将所述核酸构建表达框，再导入宿主菌中得到的重组菌株。
9、本发明的一个目的是提供产单萜物质的重组酿酒酵母的构建方法。
10、本发明提供了一种产单萜物质的重组酿酒酵母的构建方法，包括：将单萜合成酶基因导入酿酒酵母，得到产单萜的重组酿酒酵母。
11、例如，所述酿酒酵母为能够积累单萜合成前体牻牛儿基二磷酸盐（gpp）的酿酒酵母。
12、可选地，根据上述的构建方法，所述单萜合成酶基因编码的单萜合成酶氨基酸序列为seq id no.10、11、12、13所示。可选地，根据上述的构建方法，所述酿酒酵母为提高出发酿酒酵母中法尼基焦磷酸合成酶erg20、3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶a thmg1、乙酰辅酶a酰基转移酶mvae、hmg-coa合成酶mvas-m、异戊烯基焦磷酸异构酶idi1、甲羟戊酸激酶erg12、mvap激酶erg8和/或mvapp脱羧酶erg19的含量和/或活性。例如，提高酶的含量和/或活性通过增加所述出发酿酒酵母相应酶基因的拷贝数实现。
13、可选地，所述出发酿酒酵母为tib h1（中国专利202110934151 .4），其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为cgmcc no.21000。
14、可选地，根据上述的构建方法，包括：对所述出发酿酒酵母还进行如下至少一种改造，获得所述酿酒酵母：a1、导入法尼基焦磷酸合成酶基因96位和127位双点突变基因erg20f96w/n127w基因；a2、导入thmg1基因；a3、导入mvae基因；a4、导入mvas-m基因；a5、导入idi1基因；a6、导入erg12基因；a7、导入erg8基因；a8、导入erg19基因。
15、可选地，所述erg20f96w/n127w基因编码的erg20f96w/n127w蛋白质的序列如seq idno.14所示；和/或，所述thmg1基因编码的thmg1蛋白质的序列为genbank登陆号：ajs96703.1序列第530-1054位所示；和/或，所述mvae基因编码的mvae蛋白质的序列为genbank登陆号aag02439.1所示；和/或，所述mvas-m基因编码的mvas-m蛋白质的序列为genbank登陆号aag02438.1第110位丙氨酸替换为甘氨酸所示；和/或，所述idi1基因编码的idi1蛋白质的序列为genbank登陆号：np_015208.1序列所示；和/或，所述erg12基因编码的erg12蛋白质的序列为genbank登陆号：np_013935.1序列所示；和/或，所述erg8基因编码的erg8蛋白质的序列为genbank登陆号：np_013947.1序列所示；和/或，所述erg19基因编码的erg19蛋白质的序列为genbank登陆号：np_014441.1序列所示。
16、可选地，所述erg20f96w/n127w基因序列如seq id no.1第722-1780位所示；和/或，所述thmg1基因序列如seq id no.2第800-2383位所示；和/或，所述mvae基因序列如seq idno.3第270-2681位的反向互补所示；和/或，所述mvas-m基因序列如seq id no.3第3358-4509位所示；和/或，所述idi1基因序列如seq id no.4第270-1136位的反向互补所示；和/或，所述erg12基因序列如seq id no.4第1813-3144位所示；和/或，所述erg8基因序列如seq id no.5第333-1688位的反向互补所示；和/或，所述erg19基因序列如seq id no.5第2365-3555位所示。
17、可选地，根据上述的构建方法，所述将单萜合酶基因导入出发酿酒酵母通过向所述出发酿酒酵母导入单萜合酶基因表达盒实现；和/或，所述a1通过向所述出发酿酒酵母导入erg20f96w/n127w基因表达盒实现；和/或，所述a2通过向所述出发酿酒酵母导入thmg1基因表达盒实现；和/或，所述a3通过向所述出发酿酒酵母导入mvae基因表达盒实现；和/或，所述a4通过向所述出发酿酒酵母导入mvas-m基因表达盒实现；和/或，所述a5通过向所述出发酿酒酵母导入idi1基因表达盒实现；和/或，所述a6通过向所述出发酿酒酵母导入erg12基因表达盒实现；和/或，所述a7通过向所述出发酿酒酵母导入erg8基因表达盒实现；和/或，所述a8通过向所述出发酿酒酵母导入erg19基因表达盒实现。
18、可选地，根据上述的构建方法，所述单萜合成酶基因表达盒包括启动子、所述单萜合成酶基因和终止子，所述启动子为gal2；所述终止子为cyc1。例如，所述单萜合成酶基因表达盒序列为seq id no.6的72-2159位所示、seq id no.7的72-2117位、seq id no.8的72-2117位所示、seq id no.9的72-2129位所示。
19、可选地，根据上述的构建方法，所述erg20f96w/n127w基因表达盒序列如seq id no.1第54-2141位所示；和/或，所述thmg1基因表达盒序列如seq id no.2第75-2769位所示；和/或，所述mvae基因表达盒序列如seq id no.3第78-3357位的反向互补所示；和/或，所述mvas-m基因表达盒序列如seq id no.3第2682-4728位所示；和/或，所述idi1基因表达盒序列如seq id no.4第69-1812位的反向互补所示；和/或，所述erg12基因表达盒序列如seqid no.4第1137-3256位所示；和/或，所述erg8基因表达盒序列如seq id no.5第74-2364位的反向互补所示；和/或，所述erg19基因表达盒序列如seq id no.5第1689-3774位所示。
20、本发明还提供采用上述的构建方法构建的重组酿酒酵母。
21、本发明的另一个目的是提供生产单萜的方法。
22、本发明提供了生产单萜的方法，包括培养上述重组酿酒酵母，得到发酵产物，即得到桉叶素、a-蒎烯、桧烯、月桂烯、蒈烯、萜品油烯、罗勒烯、a-萜品醇。
23、本发明还提供单萜合成酶及其编码基因在制备生产单萜中的应用，所述单萜合成酶的氨基酸序列为seq id no.10、11、12或13所示，或与所示seq id no.10、11、12或13所示核苷酸序列具有至少70％同一性，优选至少80％同一性，至少90％同一性，至少95％同一性，更优选至少99%同一性，仍然具有所述功能；更优选所述单萜合成酶的编码基因来源于冬虫夏草菌（ophiocordyceps sinensis)，炭团菌（hypoxylon)。
24、本发明还提供了下述任一一种应用，x1、上述的构建方法在制备生产单萜产品中的应用；x2、上述的构建方法在生产单萜中的应用；x3、上述的重组酿酒酵母在制备生产单萜产品中的应用；x4、上述的重组酿酒酵母在生产单萜中的应用；x5、单萜合酶基因在制备生产桉叶素产品中的应用；x6、单萜合酶基因在生产桉叶素中的应用；x7、单萜合酶在制备生产桉叶素产品中的应用；x8、单萜合酶在生产桉叶素中的应用。可选地，上述应用中，所述单萜合酶基因编码的单萜合成酶氨基酸序列为（seq id no .10-13）所示。又例如，所述桉叶素合成酶基因的核苷酸序列可为seq id no.6第777-1940位；seq id no.7第777-1898位；seq id no.8第777-1898位；seq id no.9第777-1910位所示。
25、桉叶素是许多不同植物精油的重要组成部分，它是一种单萜物质。本发明通过挖掘筛选到具有合成单萜能力桉叶素合成酶，为生产桉叶素提供新的途径。同时，进一步地通过对酿酒酵母中mva途径进行强化并导入单萜合酶基因，构建出产桉叶素的重组酿酒酵母；为单萜的生物合成方面提供有力酶及菌株研究基础，对于单萜的生产具有重要意义。