一种牡丹花粉蛋白多肽及其制备方法与应用与流程

1.本发明涉及花粉发酵技术领域，具体涉及一种牡丹花粉蛋白多肽及其制备方法与应用。


背景技术：

2.花粉的处理方法包括机械法，酶解法和发酵法。其中，机械法，但该方法过程激烈，对设备要求高。酶解法虽然过程简单，但需要严格控制反应条件。发酵法对花粉进行处理，既能做到抑菌、破壁，又能脱敏，不破坏花粉中的营养成分，但现有技术中，采用发酵法对牡丹花粉进行处理时，往往存在牡丹蛋白多肽的纯度不高的问题。


技术实现要素：

3.针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种牡丹花粉蛋白多肽及其制备方法与应用。
4.为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：本发明的第一方面，提供了一种牡丹花粉蛋白多肽的制备方法，包括以下步骤：（1）将枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌接种于牡丹花粉蛋白发酵培养液中，30~40℃下发酵9~18h，待发酵结束后，在沸水浴中灭菌；（2）将灭菌后的牡丹花粉蛋白发酵培养液离心，取上清液，过滤，取滤液进行干燥，即得牡丹花粉蛋白多肽；优选的，步骤（1）中，将枯草芽孢杆菌种子液与地衣芽孢杆菌种子液等体积混合后，得混合种子液，将混合种子液接种于牡丹花粉蛋白发酵培养液中。
5.进一步优选的，混合种子液的接种量为牡丹花粉蛋白发酵培养液体积的2%~3%。
6.进一步优选的，混合种子液中，枯草芽孢杆菌的活菌数为1.6
×
108~1.8
×
108cfu/ml，地衣芽孢杆菌的活菌数为2.0
×
108~2.2
×
108cfu/ml。
7.优选的，步骤（2）中，离心转速为6000~8000 r/min，离心时间为10~20min。
8.优选的，步骤（2）中，干燥方法为喷雾干燥或真空冷冻干燥。
9.进一步优选的，喷雾干燥条件为0.08-0.2个大气压、70-130℃；真空冷冻干燥条件为-55~
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40℃。
10.优选的，步骤（2）中，过滤方法为：采用0.45μm滤膜过滤，然后以10kda超滤膜超滤。
11.优选的，步骤（1）中，所述牡丹花粉蛋白发酵培养液由以下重量份原料组成：8~10份牡丹花粉蛋白、0.2~0.3份葡萄糖、0.5~0.7份氯化钠、0.01~0.02份樟脑磺酸和160~180份蒸馏水。
12.进一步优选的，所述牡丹花粉蛋白由如下方法制备而成：（a）将牡丹花粉粉碎、冷冻后，加入热水，搅拌，经超声处理后，得牡丹花粉溶液；（b）将牡丹花粉溶液搅拌、离心后，收集上清液，向上清液中加入硫酸铵固体，搅拌离心，收集沉淀，再向沉淀中加入磷酸盐缓冲液溶解，超滤，得牡丹花粉粗蛋白溶液；
（c）将牡丹花粉粗蛋白溶液于真空冷冻干燥，得牡丹花粉蛋白。
13.优选的，步骤（a）中，冷冻温度为-30℃~
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60℃，冷冻时间为12-24h。
14.优选的，步骤（a）中，超声强度为200~600w，超声时间为10~40min。
15.优选的，步骤（a）中，牡丹花粉与热水的料液比为1g:（10-30）ml。
16.优选的，步骤（b）中，所述搅拌温度为30~50℃，搅拌时间为4~6h。
17.优选的，步骤（b）中，离心转速为6000~8000r/min，离心时间为10~20min。
18.优选的，步骤（b）中，磷酸盐缓冲液的ph为5.0~7.0。
19.优选的，步骤（b）中，超滤采用100kda的超滤膜。
20.优选的，步骤（c）中，真空冷冻干燥的温度为-60℃~
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40℃，真空冷冻干燥时间为6~8h。
21.本发明的第二方面，提供了一种牡丹花粉蛋白多肽。
22.本发明的第三方面，提供了一种牡丹花粉蛋白多肽在制备降血压产品中的应用。
23.本发明的有益效果：本发明采用将牡丹花粉进行破壁处理后，提取牡丹花粉粗蛋白、发酵酶解牡丹花粉粗蛋白，干燥得到牡丹花粉蛋白多肽。在发酵过程中，采用枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌混合发酵的形式,有效的加快了粗蛋白酶解形成多肽的过程，同时，还能保证牡丹花粉蛋白多肽的提取率。
24.其中，枯草芽孢杆菌能发酵产生中性蛋白酶，地衣芽胞杆菌则能通过发酵产生碱性蛋白酶，在中性蛋白酶和碱性蛋白酶的协同增强作用下，能使牡丹花粉粗蛋白有效的转化形成多肽。同时，本发明采用了温差-超声的复合破壁的方式，能有效的将牡丹花粉中的蛋白质与脂质、纤维素等分离开，提高了牡丹花粉的破壁率，使后续操作中更好的提取牡丹花粉蛋白。
25.本发明制备得到的牡丹花粉蛋白多肽良好的保持了其中的营养成分，将人体难吸收的物质通过发酵法转化为易消化吸收的小分子，保证快速被人体消化吸收，提供机体所需要的能量。
具体实施方式
26.应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本技术提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本技术所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
27.为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本技术的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本技术的技术方案。
28.本发明实施例中所用的试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。
29.具体的：地衣芽孢杆菌购于中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌株编号为cicc 25064；枯草芽孢杆菌购于中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌株编号为cicc 10087。
30.实施例1（1）将牡丹花粉置于粉碎机中进行粉碎，在-30℃冷冻24h，再加入热水，其中，粉碎冷冻后的牡丹花粉与热水之间的料液比为1g：10ml，在200w的超声强度下，超声处理40min，
得牡丹花粉溶液；（2）将牡丹花粉溶液于30℃下搅拌6h，在6000r/min下离心20min，过滤，取上清液，在上清液中逐级加入硫酸铵固体，使硫酸铵饱和度依次达到20%、40%、60%和80%，每次搅拌后于6000r/min下离心20min，收集各级沉淀，向沉淀中加ph为5.0的磷酸盐缓冲溶液，以100kda的超滤膜进行超滤，得粗蛋白溶液；（3）将粗蛋白溶液于-60℃下真空干燥8h，得牡丹花粉蛋白；（4）将枯草芽孢杆菌种子液和地衣芽孢杆菌种子液等体积混合，得混合种子液，将混合种子液按牡丹花粉蛋白发酵培养液体积的2%接种于牡丹花粉蛋白发酵培养液中，于30℃，摇床转速为200r/min条件下，恒温水浴发酵20h，发酵结束后，在沸水浴中灭菌；其中，混合种子液中枯草芽孢杆菌的活菌数为1.6
×
108cfu/ml，地衣芽孢杆菌的活菌数为2.0
×
108cfu/ml。
31.牡丹花粉蛋白发酵培养液由如下方法制备而成：取8份牡丹花粉蛋白、0.2份葡萄糖、0.5份氯化钠和0.01份樟脑磺酸溶解于160份蒸馏水中，调节ph为6.6，在110℃下灭菌30min。
32.（5）将灭菌后的发酵培养液于6000r/min下离心20min，取上清液，用0.45μm滤膜过滤，然后以10kda超滤膜超滤，取滤液进行喷雾干燥，即得牡丹花粉蛋白多肽。
33.其中，喷雾干燥的条件为0.08个大气压，70℃。
34.实施例2（1）将牡丹花粉置于粉碎机中进行粉碎，在-60℃冷冻12h，再加入热水，其中，粉碎冷冻后的牡丹花粉与热水之间的料液比为1g：30ml，在600w的超声强度下，超声处理10min，得牡丹花粉溶液；（2）将牡丹花粉溶液于50℃下搅拌4h，在8000r/min下离心10min，过滤，取上清液，在上清液中逐级加入硫酸铵固体，使硫酸铵饱和度依次达到20%、40%、60%和80%，每次搅拌后于6000r/min下离心20min，收集各级沉淀，向沉淀中加ph为7.0的磷酸盐缓冲溶液，以100kda的超滤膜进行超滤，得粗蛋白溶液；（3）将粗蛋白溶液于-40℃下真空干燥6h，得牡丹花粉蛋白；（4）将枯草芽孢杆菌种子液和地衣芽孢杆菌种子液等体积混合，得混合种子液，将混合种子液按牡丹花粉蛋白发酵培养液体积的3%接种于牡丹花粉蛋白发酵培养液中，于38℃，摇床转速为240r/min条件下，恒温水浴发酵9h，发酵结束后，在沸水浴中灭菌；其中，混合种子液中枯草芽孢杆菌的活菌数为1.8
×
108cfu/ ml，地衣芽孢杆菌的活菌数为2.2
×
108cfu/ ml。
35.牡丹花粉蛋白发酵培养液由如下方法制备而成：取10份牡丹花粉蛋白、0.3份葡萄糖、0.7份氯化钠和0.02份樟脑磺酸溶解与180份蒸馏水中，调节ph为6.8，在120℃下灭菌20min。
36.（5）将灭菌后的发酵培养液于8000r/min下离心10min，取上清液，用0.45μm滤膜过滤，然后以10kda超滤膜超滤，取滤液进行-55℃~
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40℃下真空冷冻干燥，即得牡丹花粉蛋白多肽。
37.实施例3（1）将牡丹花粉置于粉碎机中进行粉碎，在-45℃冷冻18h，再加入热水，其中，粉碎
冷冻后的牡丹花粉与热水之间的料液比为1g：20ml，在400w的超声强度下，超声处理25min，得牡丹花粉溶液；（2）将牡丹花粉溶液于40℃下搅拌5h，在7000r/min下离心15min，过滤，取上清液，在上清液中逐级加入硫酸铵固体，使硫酸铵饱和度依次达到20%、40%、60%和80%，每次搅拌后于6000r/min下离心20min，收集各级沉淀，向沉淀中加ph为6.0的磷酸盐缓冲溶液，以100kda的超滤膜进行超滤，得粗蛋白溶液；（3）将粗蛋白溶液于-50℃下真空干燥7h，得牡丹花粉蛋白；（4）将枯草芽孢杆菌种子液和地衣芽孢杆菌种子液等体积混合，得混合种子液，将混合种子液按牡丹花粉蛋白发酵培养液体积的3%接种于牡丹花粉蛋白发酵培养液中，于34℃，摇床转速为220r/min条件下，恒温水浴发酵14h，发酵结束后，在沸水浴中灭菌；其中，混合种子液中，枯草芽孢杆菌的活菌数为1.7
×
108cfu/ ml，地衣芽孢杆菌的活菌数为2.1
×
108cfu/ ml。
38.牡丹花粉蛋白发酵培养液由如下方法制备而成：取9份牡丹花粉蛋白、0.25份葡萄糖、0.6份氯化钠和0.015份樟脑磺酸溶解与170份蒸馏水中，调节ph为6.7，在115℃下灭菌25min。
39.（5）将灭菌后的发酵培养液于7000r/min下离心15min，取上清液，用0.45μm滤膜过滤，然后以10kda超滤膜超滤，取滤液进行喷雾干燥，即得牡丹花粉蛋白多肽。
40.其中，喷雾干燥的条件为0.2个大气压，130℃。
41.对比例1（1）将牡丹花粉置于粉碎机中进行粉碎，在-45℃冷冻18h，再加入热水，其中，粉碎冷冻后的牡丹花粉与热水之间的料液比为1g：20ml，在400w的超声强度下，超声处理25min，得牡丹花粉溶液；（2）将牡丹花粉溶液于40℃下搅拌5h，在7000r/min下离心15min，过滤，取上清液，在上清液中逐级加入硫酸铵固体，使硫酸铵饱和度依次达到20%、40%、60%和80%，每次搅拌后于6000r/min下离心20min，收集各级沉淀，向沉淀中加ph为6.0的磷酸盐缓冲溶液，以100kda的超滤膜进行超滤，得粗蛋白溶液；（3）将粗蛋白溶液于-50℃下真空干燥7h，得牡丹花粉蛋白；（4）将枯草芽孢杆菌种子液按牡丹花粉蛋白发酵培养液体积的3%接种于牡丹花粉蛋白发酵培养液中，于34℃，摇床转速为220r/min条件下，恒温水浴发酵14h，发酵结束后，在沸水浴中灭菌；其中，枯草芽孢杆菌种子液中活菌数为1.7
×
108cfu/ ml。
42.牡丹花粉蛋白发酵培养液由如下方法制备而成：取9份牡丹花粉蛋白、0.25份葡萄糖、0.6份氯化钠和0.015份樟脑磺酸溶解与170份蒸馏水中，调节ph为6.7，在115℃下灭菌25min。
43.（5）将灭菌后的发酵培养液于7000r/min下离心15min，取上清液，用0.45μm滤膜过滤，然后以10kda超滤膜超滤，取滤液进行喷雾干燥，即得牡丹花粉蛋白多肽。
44.其中，喷雾干燥的条件为0.2个大气压，130℃。
45.对比例2（1）将牡丹花粉置于粉碎机中进行粉碎，在-45℃冷冻18h，再加入热水，其中，粉碎
冷冻后的牡丹花粉与热水之间的料液比为1g：20ml，在400w的超声强度下，超声处理25min，得牡丹花粉溶液；（2）将牡丹花粉溶液于40℃下搅拌5h，在7000r/min下离心15min，过滤，取上清液，在上清液中逐级加入硫酸铵固体，使硫酸铵饱和度依次达到20%、40%、60%和80%，每次搅拌后于6000r/min下离心20min，收集各级沉淀，向沉淀中加ph为6.0的磷酸盐缓冲溶液，以100kda的超滤膜进行超滤，得粗蛋白溶液；（3）将粗蛋白溶液于-50℃下真空干燥7h，得牡丹花粉蛋白；（4）将地衣芽孢杆菌种子液按牡丹花粉蛋白发酵培养液体积的3%接种于牡丹花粉蛋白发酵培养液中，于34℃，摇床转速为220r/min条件下，恒温水浴发酵14h，发酵结束后，在沸水浴中灭菌；其中，地衣芽孢杆菌种子液中活菌数为2.1
×
108cfu/ ml。
46.牡丹花粉蛋白发酵培养液的制备方法为：取9份牡丹花粉蛋白、0.25份葡萄糖、0.6份氯化钠和0.015份樟脑磺酸溶解与170份蒸馏水中，调节ph为6.7，在115℃下灭菌25min。
47.（5）将灭菌后的发酵培养液于7000r/min下离心15min，取上清液，用0.45μm滤膜过滤，然后以10kda超滤膜超滤，取滤液进行喷雾干燥，即得牡丹花粉蛋白多肽。
48.其中，喷雾干燥的条件为0.2个大气压，130℃。
49.试验例1（1）取实施例3，对比例1和对比例2制备得到的牡丹花粉蛋白多肽加水，配置成相同浓度的样品溶液；（2）分别取2.5ml 实施例3、对比例1和对比例2的样品溶液加入 2.5ml 10%的三氯乙酸（tca）水溶液，于漩涡混合仪上混合均匀，静置 10min，然后在 4000r/min 下离心 15min，将上清液，得活性多肽；（3）将活性多肽全部转移到 50ml 容量瓶中，并用 5%的tca定容至刻度，摇匀。然后分别取 6.0ml 上述溶液置另一试管中，加入双缩脲试剂 4.0ml，其中，样品溶液与双缩脲试剂的体积比为3:2，于漩涡混合仪上混合均匀， 静置 10min, 2000r/min 离心 10min 取上清液于540min下测定 od 值，对照标准曲线即得样品溶液中的多肽浓度c(mg/ml), 进而可得样品溶液中多肽含量。
50.其中，标准曲线为：y= 0.3681x+0.0013 (r2=1)。
51.多肽纯度（%）=[(样品溶液中多肽含量
×
样品溶液液体积)/样品质量]
×
100%,样品质量为实施例3、对比例1和对比例2中制备的牡丹花粉蛋白多肽的质量。
[0052]
表1 实施例3、对比例和对比例2中多肽含量及多肽纯度
由表1可以看出，实施例3通过牡丹花粉蛋白多肽制备得到的牡丹花粉多肽的含量均远高于对比例1只采用枯草芽孢杆菌发酵制备得到的牡丹花粉蛋白多肽和对比例2只采用地衣芽孢杆菌制备得到的牡丹花粉蛋白多肽，同时，实施例3中制备得到的牡丹花粉蛋白多肽纯度也相对于对比例1和对比例2中的牡丹花粉蛋白多肽纯度高。由此可见，枯草芽孢杆菌在发酵过程中产生的中性蛋白酶、地衣芽孢杆菌在发酵过程中产生的碱性蛋白酶，在二者的协同增强作用下，明显提高了牡丹花粉蛋白多肽的纯度。
[0053]
试验例2参考专利cn107699599b中的实施例4动物实验中的方法，进行下列试验。
[0054]
选取14-17周龄雄性自发高血压（shr）大鼠进行试验，体重280
±
20g。所述shr大鼠购于济南朋悦实验动物繁育有限公司。饲养环境温度为22
±
2℃，湿度为40-70％。12h明暗交替光照，自由采食和饮水。shr大鼠适应性喂养一周后，进行试验，选取收缩压（sbp）为170mmhg以上的shr大鼠进行降压试验。
[0055]
选取上述shr大鼠30只分成3组进行灌胃试验，分别灌胃蒸馏水、实施例3中的牡丹花粉蛋白多肽、对比例1中的牡丹花粉蛋白多肽和对比例2中的牡丹花粉蛋白多肽，每天灌胃1次，每次灌胃剂量为3mg/kg
·
bw。连续灌胃6周，每周测量一次sbp（收缩压），结果如表2所示。
[0056]
表2 灌胃试验后shr大鼠的sbp值由表2可以看出，随着灌胃时间的增长，灌胃实施例3和对比例1-2牡丹花粉蛋白多肽的shr大鼠的收缩压相较于灌胃蒸馏水组的shr大鼠的收缩压有明显的下降，且灌胃实施例3的牡丹花粉蛋白多肽的收缩压值低于对比例1-2的牡丹花粉蛋白多肽，由此可见，牡丹花粉蛋白多肽有显著的降血压的功效，可以用于制备降血压产品，同时，采用枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌混合发酵制备的牡丹花粉蛋白多肽的降压效果优于单一菌种发酵的牡丹花粉蛋白多肽。
[0057]
以上所述仅为本技术的优选实施例而已，并不用于限制本技术，对于本领域的技术人员来说，本技术可以有各种更改和变化。凡在本技术的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本技术的保护范围之内。