一种果糖-1,6-二磷酸光学探针及其制备方法和应用

本发明涉及光学探针，尤其涉及一种果糖-1,6-二磷酸光学探针及其制备方法和应用。

背景技术：

1、果糖-1,6-二磷酸(fbp)是细胞内天然存在的一种化合物,是细胞在糖酵解途径中产生的一个重要中间产物,在细胞中通过调节糖代谢中若干酶的活性产生药理作用。

2、果糖-1,6-二磷酸是糖酵解途径、糖异生过程中的重要代谢物，由6-磷酸果糖在磷酸果糖激酶的催化下产生，之后在醛缩酶的作用下生成磷酸二羟丙酮和3-磷酸甘油醛，最终生成丙酮酸进入三羧酸循环途径。除此之外，果糖-1,6-二磷酸调控多种代谢途径中多种酶的活性。

3、由于其在代谢途径中的重要作用，果糖-1,6-二磷酸被用于治疗代谢相关、呼吸系统相关疾病，并取得了良好的疗效。比如生物体内糖代谢异常时引起atp的含量的降低进而导致血红蛋白的携氧能力下降，造成代谢紊乱产生疾病，而果糖-1,6-二磷酸能促使细胞体内糖的分解，治疗相关疾病；在呼吸系统疾病方面,果糖-1,6-二磷酸通过促进细胞内磷酸果糖激酶的分解来提升生物体内磷酸池的含量进而提升肺部平滑肌的舒张能力，实现受损细胞的修复。

4、目前常见果糖-1,6-二磷酸的检测方法主要有色谱法(ma b等.european journalof pharmacology,2013,718(1-3),524-532)、酶法(iwamoto s等.applied andenvironmental microbiology,2007,73(17),5676-5678)、和显色法(wang c等.journalof biomedical engineering,2000,17(3),363-365)等。色谱法酶法检测具有较好的特异性，但具有成本较高的缺点(伍良涌等.中国药品标准,2007,8(4),63-65)；色谱法能快速的检测果糖-1,6-二磷酸的含量，能检测较低含量的果糖-1,6-二磷酸，但其实验过程中容易出现误差(吴燕等.中南医学科学杂志,2000,(6),608-609)；而显色法则存在果糖和单磷酸果糖等物质的干扰问题(杜振宁等.中国生化药物杂志,1993,(2),59-62)，并且上述几种方法只适合体外检测，无法实时监控活细胞的果糖-1,6-二磷酸浓度变化。因此，开发新的特异性好响应速度快且可以对体内果糖-1,6-二磷酸实时定量检测的方法具有重要的意义。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供在细胞内、外实时定位、高通量、定量检测果糖-1,6-二磷酸的探针和方法。

2、为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

3、本发明第一方面提供一种果糖-1,6-二磷酸结合蛋白变体，其：

4、(1)具有seq id no:1所示的序列并且在选自以下的1个、2个或3个、4个、5个或更多个位点具有突变：t148、r175、g176、g177、l178、e180、d181、v182、k183、n184、q185、f271，所述突变包括氨基酸的修饰、取代或缺失，

5、(2)是(1)的具有第88-340位氨基酸的截短变体，或

6、(3)是与(1)或(2)的序列具有至少70％序列相同性并具有(1)所述突变并保留对果糖-1,6-二磷酸结合能力的序列。

7、在一个或多个实施方案中，所述突变的位点选自以下任一组中的1个、2个或3个、4个、5个：(a)t148、r175、g176、g177、l178、d181、v182、k183、n184、q185，(b)g177、l178、e180、d181、v182、n184、q185、f271。

8、在一个或多个实施方案中，所述突变包括选自以下任一组的位点处的突变：(1)g177和l178，(5)d181和v182，(6)e180和d181，(7)n184和q185；或者，所述突变包含选自以下任一组的位点处的突变：(1)g177、l178，(2)g177、l178和q185，(3)g177、l178和t148，(4)g177、l178和f271，(5)d181、v182，(6)e180、d181，(7)n184、q185，(8)n184、q185、d181、v182、g177，(9)n184、q185、g177，(10)n184、q185、d181、v182。

9、在一个或多个实施方案中，t148突变为s。在一个或多个实施方案中，g177突变为a、i、l、m或n，优选突变为l或m。在一个或多个实施方案中，l178突变为y、f或n，优选突变为n。在一个或多个实施方案中，e180突变为g。在一个或多个实施方案中，d181突变为f、l或e，优选突变为e。在一个或多个实施方案中，v182突变为f、l或g，优选突变为g。在一个或多个实施方案中，n184突变为v。在一个或多个实施方案中，q185突变为s、a、t、d或p。在一个或多个实施方案中，f271突变为y。

10、在一个或多个实施方案中，所述突变包含选自以下的一个或多个：g177l、d181e、v182g、n184v、q185a。

11、在一个或多个实施方案中，所述突变包含选自以下任一组的突变：(1)g177a和l178y，(2)g177i和l178f，(3)g177l和l178y，(4)g177m和l178n，(5)g177n和l178y，(6)g177m、l178n和q185s，(7)g177m、l178n和q185a，(8)g177m、l178n和q185t，(9)g177m、l178n和q185d，(10)g177、l178和t148s，(11)g177、l178和f271y，(12)d181f和v182f，(13)d181l和v182l，(14)e180g和d181g，(15)n184v和q185p，(16)n184v、q185p、d181e、v182g和g177l，(17)n184v、q185p和g177l，(18)n184v、q185p、d181e和v182g。

12、本发明另一方面提供一种果糖-1,6-二磷酸光学探针，包含果糖-1,6-二磷酸敏感多肽和光学活性多肽，其中光学活性多肽位于果糖-1,6-二磷酸敏感多肽的序列内。果糖-1,6-二磷酸敏感多肽被光学活性多肽分为第一部分和第二部分。

13、在一个或多个实施方案中，所述果糖-1,6-二磷酸光学探针，包括果糖-1,6-二磷酸敏感多肽b和光学活性多肽a，其中光学活性多肽a位于果糖-1,6-二磷酸敏感多肽b的序列内，将果糖-1,6-二磷酸敏感多肽b分为第一部分b1和第二部分b2，形成b1-a-b2式的探针结构。

14、在一个或多个实施方案中，光学活性多肽位于果糖-1,6-二磷酸敏感多肽的残基174-185和/或201-208之间，编号对应于果糖-1,6-二磷酸敏感多肽的全长。优选地，光学活性多肽位于果糖-1,6-二磷酸敏感多肽的选自下述位点中的任一个或多个：174/175，174/176，174/177，174/178，174/179，174/180，174/181，174/182，174/183，174/184，174/185，155/176，175/177，175/178，175/179，175/180，175/181，175/182，175/183，175/184，175/185，176/177，176/178，176/179，176/180，176/181，176/182，176/183，176/184，176/185，177/178，177/179，177/180，177/181，177/182，177/183，177/184，177/185，178/179，178/180，178/181，178/182，178/183，178/184，178/185，179/180，179/181，179/182，179/183，179/184，179/185，180/181，180/182，180/183，180/184，180/185，181/182，181/182，181/183，181/184，181/185，182/183，182/184，182/185，183/184，183/185，184/185，201/202，201/203，201/204，201/205，201/206，201/207，201/208，202/203，202/204，202/205，202/206，202/207，202/208，203/204，203/205，203/206，203/207，203/208，204/205，204/206，204/207，204/208，205/206，205/206，205/207，205/208，206/207，206/208和/或207/208。更优选地，光学活性多肽位于果糖-1,6-二磷酸敏感多肽的选自下述位点中的任一个或多个：176/177，176/178，177/181，179/180，182/184，182/185，203/206，203/207和203/208。

15、在一个或多个实施方案中，所述果糖-1,6-二磷酸敏感多肽是果糖-1,6-二磷酸结合蛋白或其功能变体，其中，果糖-1,6-二磷酸结合蛋白的功能变体在与光学活性多肽连接处的7个氨基酸内具有突变。

16、在一个或多个实施方案中，果糖-1,6-二磷酸敏感多肽具有：

17、(1)seq id no:1所示的序列或其具有第88-340位氨基酸的截短变体，或与它们有至少70％序列相同性并保留对果糖-1,6-二磷酸结合活性的序列，

18、(2)本文第一方面任一实施方案所述的果糖-1,6-二磷酸结合蛋白变体的序列，或

19、(3)与(2)所述序列具有至少70％序列相同性并具有(2)所述突变并保留对果糖-1,6-二磷酸敏感性的序列。

20、在一个或多个实施方案中，所述光学活性多肽是荧光蛋白或其功能变体，其中，荧光蛋白的功能变体在与光学活性多肽连接处的3个氨基酸内具有突变。

21、在一个实施方式中，荧光蛋白选自黄色荧光蛋白、橘黄色荧光蛋白、红色荧光蛋白、绿色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白、苹果红荧光蛋白。在一个实施方式中，荧光蛋白具有seqid no:2-9中任一所示的序列。

22、在一个或多个实施方案中，荧光蛋白的功能变体在第1-3位，优选第1位，的氨基酸处具有突变。优选地，荧光蛋白的功能变体包括荧光蛋白的第1位氨基酸突变为i或v的突变。

23、在一个或多个实施方案中，荧光蛋白的功能变体具有seq id no:2所示的序列并在y1位点具有突变。优选地，所述突变为y1i或y1v。

24、在一个实施方式中，光学探针还包含侧接所述光学活性多肽的一个或多个接头。本发明所述接头可以是任何长度的任何氨基酸序列。在一个实施方式中，光学活性多肽侧翼包含不超过5个氨基酸的接头，例如0、1、2、3、4个氨基酸的接头。在一个实施方式中，光学活性多肽侧翼的接头包含氨基酸y。在一个实施方式中，接头y位于光学活性多肽的n端和/或c端。在一个实施方式中，光学探针如下所示：果糖-1,6-二磷酸敏感多肽的第一部分b1、y、光学活性多肽a、果糖-1,6-二磷酸敏感多肽的第二部分b2。在一个实施方式中，本发明光学探针不包含接头。

25、在一个实施方式中，本发明光学探针还包含定位序列，用于将探针定位到例如细胞的特定细胞器。

26、在一个或多个实施方案中，果糖-1,6-二磷酸敏感多肽是seq id no:1的具有第88-340位氨基酸的截短变体，并且光学活性多肽位于果糖-1,6-二磷酸敏感多肽的选自下述位点中的任一个或多个：176/177，176/178，177/181，179/180，182/184，182/185，203/206，203/207和203/208。优选地，光学活性多肽如seq id no:2所示。

27、在一个或多个实施方案中，果糖-1,6-二磷酸敏感多肽是seq id no:1的具有第88-340位氨基酸的截短变体，光学活性多肽位于果糖-1,6-二磷酸敏感多肽的选自下述位点中的任一个或多个：176/177，177/181，179/180或182/184，并且所述光学探针具有选自以下的一个或多个突变：果糖-1,6-二磷酸敏感多肽的t148s、g177a、g177i、g177l、g177m、g177n、l178y、l178f、l178y、l178n、l178y、l178n、e180g、d181e、d181f、d181l、d181g、v182f、v182l、v182g、n184v、q185a、q185s、q185a、q185t、q185d、q185p、f271y，光学活性多肽的第1位氨基酸突变为v或i。优选地，光学活性多肽如seq id no:2所示。

28、在一个或多个实施方案中，果糖-1,6-二磷酸敏感多肽是seq id no:1的具有第88-340位氨基酸的截短变体，光学活性多肽位于果糖-1,6-二磷酸敏感多肽的选自下述位点中的任一个或多个：176/177，177/181，179/180或182/184，所述光学探针具有选自以下任一组所示的突变：(1)果糖-1,6-二磷酸敏感多肽的g177a和l178y，(2)果糖-1,6-二磷酸敏感多肽的g177i和l178f，(3)果糖-1,6-二磷酸敏感多肽的g177l和l178y，(4)果糖-1,6-二磷酸敏感多肽的g177m和l178n，(5)果糖-1,6-二磷酸敏感多肽的g177n和l178y，(6)果糖-1,6-二磷酸敏感多肽的g177m、l178n和q185s，(7)果糖-1,6-二磷酸敏感多肽的g177m、l178n和q185a，(8)果糖-1,6-二磷酸敏感多肽的g177m、l178n和q185t，(9)果糖-1,6-二磷酸敏感多肽的g177m、l178n和q185d，(10)果糖-1,6-二磷酸敏感多肽的g177m、l178n和t148s，(11)果糖-1,6-二磷酸敏感多肽的g177m、l178n和f271y，(12)果糖-1,6-二磷酸敏感多肽的d181f和v182f，(13)果糖-1,6-二磷酸敏感多肽的d181l和v182l，(14)果糖-1,6-二磷酸敏感多肽的e180g和d181g，(15)果糖-1,6-二磷酸敏感多肽的n184v和q185p，(16)果糖-1,6-二磷酸敏感多肽的n184v、q185p、d181e、v182g、g177l，和光学活性多肽的第1位氨基酸突变为v，(17)果糖-1,6-二磷酸敏感多肽的n184v、q185p、d181e、v182g、g177l，和光学活性多肽的第1位氨基酸突变为i，(18)果糖-1,6-二磷酸敏感多肽的n184v、q185p和g177l，和光学活性多肽的第1位氨基酸突变为v，(19)果糖-1,6-二磷酸敏感多肽的n184v、q185p和g177l，和光学活性多肽的第1位氨基酸突变为i，(20)果糖-1,6-二磷酸敏感多肽的n184v、q185p、d181e和v182g，和光学活性多肽的第1位氨基酸突变为v。优选地，光学活性多肽如seq id no:2所示。

29、本发明另一方面还提供融合多肽，包含本文所述光学探针和其它多肽。在一些实施方式中，其他多肽位于所述光学探针的n端和/或c端。在一些实施方式中，其他多肽包括将光学探针定位到不同细胞器或亚细胞器的多肽、用于纯化的标签或者用于免疫印迹的标签。

30、本发明另一方面还提供核酸分子，其包含：(a)本文任一实施方案所述的多肽或探针的编码序列，或(b)(a)的互补序列，或(c)(a)或(b)的片段。所述片段是引物。

31、本发明还涉及上述核酸分子的变体，包括编码本发明光学探针或融合蛋白的片段、类似物、衍生物、可溶性片段和变体的核酸序列或其互补序列。

32、本发明另一方面还提供包含本文所述核酸分子的核酸构建物。该核酸序列编码本发明所述光学探针或融合多肽。

33、在一个或多个实施方案中，所述核酸构建物是克隆载体、表达载体或重组载体。

34、在一个或多个实施方案中，所述核酸分子与表达控制序列操作性连接。

35、在一些实施方案中，表达载体选自原核表达载体、真核表达载体和病毒载体。

36、本发明另一方面还提供一种宿主细胞，所述宿主细胞：(1)表达本发明任一实施方案所述的光学探针或融合多肽；(2)包含本发明任一实施方案所述的核酸分子；或(3)包含本发明任一实施方案所述的核酸构建物。所述宿主细胞优选大肠杆菌。

37、本发明另一方面还提供果糖-1,6-二磷酸检测试剂盒，包括本文所述光学探针或融合多肽或多核苷酸或如本文所述方法制备的光学探针。

38、在一个或多个实施方案中，所述试剂盒还包含选自以下的一种或多种试剂：缓冲液、培养基、果糖-1,6-二磷酸标准品。

39、本发明另一方面提供制备本文所述光学探针的方法，包括：提供表达本文所述光学探针或融合多肽的宿主细胞，在所述细胞表达的条件下培养所述宿主细胞，和分离光学探针或融合多肽。

40、在一个或多个实施方案中，所述方法包括以下步骤：1)将编码本文所述果糖-1,6-二磷酸光学探针的核酸分子纳入表达载体；2)将表达载体转移到宿主细胞中；2)在适合所述表达载体表达的条件下培养所述宿主细胞，3)分离果糖-1,6-二磷酸光学探针。

41、本发明另一方面还提供检测样品中果糖-1,6-二磷酸的方法，包括：使本文所述光学探针或融合多肽或宿主细胞与样品接触，和检测光学活性多肽的变化。所述检测可以在体内、体外、亚细胞或原位进行。所述样品例如血液。

42、本文另一方面还提供定量样品中果糖-1,6-二磷酸的方法，包括：使本文所述光学探针或融合多肽或宿主细胞与样品接触，检测光学活性多肽的光学变化，和根据光学活性多肽的光学变化定量样品中的果糖-1,6-二磷酸。

43、本发明另一方面还提供筛选化合物(例如药物)的方法，包括：在含果糖-1,6-二磷酸的体系中使本文所述光学探针或融合多肽或宿主细胞与候选化合物接触，检测光学活性多肽的光学变化，和根据光学活性多肽的光学变化筛选化合物。所述方法可以高通量地筛选化合物。

44、在一个或多个实施方案中，在含果糖-1,6-二磷酸的体系中使本文所述宿主细胞与候选化合物接触，并且光学活性多肽的光学变化指示所述候选化合物是否能调节细胞对果糖-1,6-二磷酸的摄取。

45、本发明另一方面还提供对所述果糖-1,6-二磷酸进行细胞内和/或外定位的方法，包括：将含果糖-1,6-二磷酸的体系与所述光学探针或所述宿主细胞接触，和检测光学活性多肽的光学变化。

46、在一个或多个实施方案中，所述体系是溶液体系、细胞体系、亚细胞体系。

47、本发明另一方面还提供本文所述果糖-1,6-二磷酸光学探针或融合多肽或宿主细胞在检测样品中的果糖-1,6-二磷酸、筛选化合物或果糖-1,6-二磷酸细胞内/外定位中的应用。在一个或多个实施方案中，所述定位是实时定位。

48、本发明的有益效果：本发明提供的果糖-1,6-二磷酸光学探针易于成熟，荧光动态变化大，特异性好，并且能够通过基因操作的方法在细胞中表达，可在细胞内外实时定位、高通量、定量检测果糖-1,6-二磷酸，省去了耗时的处理样品步骤。实验效果表明本技术所提供的果糖-1,6-二磷酸光学探针对果糖-1,6-二磷酸的最高响应达到对照的12倍以上，并且可以在细胞浆、线粒体、细胞核、内质网、溶酶体和高尔基体等亚细胞结构中对细胞进行定位、定性、定量检测，并且可以进行高通量的化合物筛选以及血液中果糖-1,6-二磷酸定量检测。