一种具有头孢菌素C乙酰水解酶活性的蛋白及其应用的制作方法

本发明涉及基因编辑，更具体的说是涉及一种具有头孢菌素c乙酰水解酶活性的蛋白及其应用。

背景技术：

1、头孢菌素c(cephalosporin c，英文缩写cpc)是自然界中发现的第二种β-内酰胺类抗生素，也是生产头孢类抗生素重要中间体7-氨基头孢烷酸(7-aca)的主要骨架原料。cpc能够抑制细菌细胞壁合成，但其抗菌活性较低。目前，工业上主要利用产黄支顶孢霉(acremonium chrysogenum，英文缩写ac)发酵生产cpc。经过多年研究，cpc在产黄支顶孢霉中的生物合成途径已经基本清楚，这为利用基因工程手段改造这一重要的工业丝状真菌奠定了良好基础。

2、在cpc发酵过程中会产生青霉素n(penicillinn，英文缩写pen)、去乙酰氧头孢菌素c(deacetoxycephalosporin c，英文缩写daoc)、去乙酰头孢菌素c(deacetylcephalosporin c，英文缩写dcpc)等中间代谢产物。其中dcpc为最主要的副产物，其结构与性质和cpc极为相似。发酵生产过程中dcpc的质量分数约为cpc质量分数的10％～30％。在目前主流的生产工艺中，dcpc虽能够与主产物cpc进行分离，但大量dcpc的积累不仅消耗发酵原料，其在余液中的残留还会造成环境污染，对工厂下游环保造成巨大压力。虽然目前已有学者对cpc废液中副产物的降低或再利用进行了一些研究，但因可操作性与经济效益低等问题，能真正应用于实际生产的工艺仍然很少。

3、以rna介导的crispr系统(clustered regularly interspaced shortpalindromic repeats，简写crispr)作为第三代基因组编辑技术，因其在基因编辑和基因修饰方面具有效率最高、成本最低和操作简便等优势。crispr技术在真菌遗传育种方面也具有重要应用前景，成为当前真菌功能基因组研究与遗传改造的研究热点。丝状真菌成熟基因编辑平台的构建，对挖掘这类微生物在工业、农业、医药等多种行业的应用价值与潜力起关键作用。在此基础上，通过中断宿主非同源末端连接的关键基因和精妙的同源重组供体设计，使得crispr/cas系统能在特定位点引入变化，提高了基因编辑的精准性。

4、dcpc在发酵液中的积累有两个主要原因：一、产黄支顶孢霉自身dcpc乙酰转移酶表达基因(cefg)启动子强度不足，转录量低，使dcpc无法有效向下转化为cpc，成为生产过程中的限速步骤之一；二、目前已知且唯一被研究过的cpc乙酰水解酶基因(cahb)存在于产黄支顶孢霉ⅷ号染色体上。cahb可表达1.4kb的单链转录子，翻译出的乙酰水解酶(cpcah)属于丝氨酸蛋白酶家族，可将发酵液中的cpc水解为dcpc，该酶活性随着发酵过程表达水平会持续下降，但有研究表明即使发酵144h后仍能检测到其活性。但最近有研究表明，单纯敲除cahb基因并不能显著降低产黄支顶孢霉菌株的dcpc产量(徐燕，冯涛，储炬.利用crispr/cas9系统构建低dcpc杂质含量的cpc工业高产菌种[j].华东理工大学学报(自然科学版)，2021,47(4):427-437.)，因此有学者推测还有其他类似基因表达产物具有将cpc水解为dcpc的乙酰水解酶活性。

5、综上，如何提供一种具有头孢菌素c乙酰水解酶活性的蛋白及其应用是本领域技术人员亟需解决的问题。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明提供了一种具有头孢菌素c乙酰水解酶活性的蛋白及其应用。

2、针对现有头孢菌素c生产菌种在发酵过程中主要副产物脱乙酰基头孢菌素c(dcpc)产量较高从而导致的cpc上游发酵碳源利用率较低，而下游分离提取成本较高的难点，本发明首先要解决的技术问题是筛选到一种新的头孢菌素c乙酰水解酶基因，该基因是产黄支顶孢霉编码基因kfh42174.1，被命名为acfaeb。

3、本发明其次要解决的技术问题是提供一株利用crispr/cas9技术敲除acfaeb编码基因kfh42174.1的产黄支顶孢霉基因编辑工程菌。

4、本发明还要解决的技术问题是提供上述产黄支顶孢霉基因编辑基因工程菌的构建方法。

5、本发明最后要解决的技术问题是提供上述产黄支顶孢霉基因编辑工程菌的应用。

6、为了克服上述技术问题和不足，本发明首先结合系统生物学数据和生物信息学预测工具进行基因挖掘，然后对疑似具有cpc乙酰水解酶活性的基因进行毕赤酵母表达，对可溶性表达的蛋白进行cpc体外水解去乙酰化能力进行研究，从中筛选得到一种新型阿魏酸酯酶b类蛋白(feruloyl esterase b-like protein)样基因的表达产物具有体外cpc乙酰水解酶活性，能够实现胞外分泌表达并水解cpc为dcpc。本发明将上述基因命名为acfaeb。本发明还对产黄支顶孢霉acfaeb基因进行了基因敲除，并对基因编辑后的基因工程菌的应用进行了研究。研究结果表明，敲除产黄支顶孢霉acfaeb基因能够显著提高cpc的产量，同时大幅减少主要副产物dcpc的生成量。

7、为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

8、一种蛋白，其氨基酸序列如seq id:no.2所示，且该蛋白具有头孢菌素c乙酰水解酶活性。

9、mgnfrvtrslaglltlgssalaqlqnipnfgnnptglsmdvyvpsnppespavvlalhpcggsgggyagqtgytsiadqkgfiaifpssfrdmncwdvasqasltrdgggdstglasmvqyaletwnadpdrifvtgsssgcmmtnvmsaaypdlfaaascysgvaagclkgspgsspisadptcangeinlsaeewaqrardiypgysgsyprfmtlhgtadwlvripnleqqlmqwstlhgveqtasnpntpqngytqlvygdgtqlvgysaegvghtvpvnsnldmewfgl，seq id:no.2。

10、进一步的，所述蛋白由seq id:no.1所示的核苷酸序列编码而成。

11、atgggcaacttccgagtcacacggagccttgcaggtctccttacgctgggctcttcagcactggcccagctgcaaaacatccccaacttcggcaacaaccccacgggcctctccatggacgtctatgtcccatccaaccccccggagagccctgccgtggttctggctctccatccttgcggtggtagcggtggtggctatgccgggcagacaggctacacttcgattgcggaccagaagggtttcatcgccatcttcccgtcctccttccgggacatgaactgctgggacgtggcctcccaggcctccttgacccgcgacggcggcggcgatagcactgggcttgccagcatggtgcagtacgccctcgagacctggaatgcggacccggacaggatctttgtcaccggcagctcctccggctgcatgatgaccaacgtcatgagcgccgcctaccccgacctcttcgccgctgcttcctgctattccggcgtggccgccgggtgcctaaagggctctcccggcagcagccccatcagcgccgacccgacctgcgccaacggcgagatcaacctgtcggccgaggagtgggctcagcgggcgcgcgacatctacccgggctactcgggtagctatccgcgattcatgaccctccacggcacggcggactggctggtccgcatccccaacctggagcagcagctgatgcagtggtcgacgctccacggggtcgagcagacggcgagcaaccccaacacgccccagaacggttatacgcagctggtctatggcgatggcacccagcttgtcggatactcggccgaaggtgttggccacaccgttccggtcaacagcaacctggacatggagtggttcggcctgtaa，seq id:no.1。

12、acfaeb基因或其编码的蛋白在发酵生产头孢菌素c中的应用，acfaeb基因的核苷酸序列如seq id:no.1所示；

13、acfaeb基因编码的蛋白的氨基酸序列如seq id:no.2所示。

14、acfaeb基因或其编码的蛋白在头孢菌素c发酵生产过程中降低去乙酰头孢菌素c副产物产量积累的应用，acfaeb基因的核苷酸序列如seq id:no.1所示；

15、acfaeb基因编码的蛋白的氨基酸序列如seq id:no.2所示。

16、高产头孢菌素c的基因工程菌，所述基因工程菌是通过对产黄枝顶头孢霉的acfaeb基因进行敲除获得，所述acfaeb基因的核苷酸序列如序列如seq id:no.1所示。

17、一种基因工程菌的构建方法，包括如下步骤:

18、(1)构建acfaeb靶基因敲除基因编辑载体；

19、(2)产黄枝顶头孢霉原生质体的制备；

20、(3)将acfaeb靶基因敲除基因编辑载体转化到产黄枝顶头孢霉原生质体中；

21、(4)筛选、验证。

22、进一步的，步骤(1)的具体操作为：

23、(11)选取acfaeb基因的sgrna-n19靶向序列seq id no.5；

24、5'-cttgcggtggtagcggtgg-3'，seq id no.5。

25、(12)设计acfaeb基因crispr敲除片段δacfaeb*，其核苷酸序列如seq id no.6所示；

26、5'-cacatacgaccatacctagtggaaaatacgggatcccgtccgctctcccatagtcaagccgctaaggggctgattagtagttgggtcggtgacgaccagcgaataccggctgttgtatgaaaggacgaaacacccttgcggtggtagcggtgggttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgctttttttt-3'，seq id no.6。

27、(13)将δacfaeb*连接到pfc332空质粒。

28、其中，将丝状真菌pfc332通用基因编辑质粒上grna scaffold序列上的靶位点改为基因acfaeb的靶位点，基因靶位点可以是任何满足以下两点条件的约20nt的dna序列，该序列在基因组中是特异存在的；靶位点紧邻着pam(protospacer adjacent motif，前间区序列邻近基序)区并位于pam区上游；使用crispr/cas9系统切割靶基因编码区位点，可激活细胞内的dna修复系统，造成切割位点附近随机插入/缺失若干碱基，如在外显子区域插入/缺失非3的整数倍碱基，将造成该基因移码突变，从而丧失原有功能。

29、所述的sgrna表达框具有启动子-(n)x-sgrna骨架-终止子结构，所述的靶位点dna具有5’-(n)x-ngg-3’结构，(n)x表示x个n，n为a、t、c或t任一碱基，x为大于15小于25的自然数。

30、上述基因工程菌、上述的构建方法构建的基因工程菌在发酵生产头孢菌素c中的应用。

31、进一步的，上述基因工程菌的种子液按照5％～15％的体积比接种于发酵培养基中；优选为按照10％的体积比。

32、进一步的，培养温度为本领域常规的培养温度，更佳地为28℃～32℃，优选为30℃。

33、进一步的，震荡培养的震荡速度更佳地为200～300rpm，优选地为230rpm。

34、进一步的，培养时间更佳地为72～120小时，优选地为110小时。

35、进一步的，种子培养基配方如下：葡萄糖5g/l，蔗糖35g/l，玉米浆10ml/l，硫酸铵8g/l，dl-甲硫氨酸0.5g/l，碳酸钙5g/l，豆油5ml/l。

36、进一步的，发酵培养基配方如下：淀粉30g/l，糊精60g/l，α-淀粉酶0.2g/l，玉米浆10ml/l，dl-甲硫氨酸6g/l，尿素2g/l，硫酸铵11g/l，硫酸镁(mgso4·7h2o)3g/l，磷酸氢二钾9g/l，碳酸钙5g/l，豆油5ml/l。

37、经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明取得的有益效果为：本发明通过对产黄枝顶头孢霉acfaeb基因进行敲除，避免了将cpc水解为dcpc，从而提高cpc发酵产量，降低了其副产物dcpc的产量。利用本发明的产黄枝顶头孢霉acfaeb基因及其编码的蛋白质能够有效促进头孢菌素c的合成速率和产量，具有很好的工业应用前景。