一种人轮状病毒HN15D2及应用的制作方法

本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种人轮状病毒hn15d2及应用。

背景技术：

1、人a组轮状病毒(rotavirus group a，rva)是全球5岁以下儿童严重胃肠炎的最常见病原体。与许多细菌性肠胃炎病原体不同，轮状病毒在发达国家和发展中国家都存在，且改善社会经济条件并不能减少轮状病毒的感染。轮状病毒的主要流行株包括g1、g2、g3、g4、g9型，婴幼儿感染率高达65％，以人轮状g1p[8]型病毒株感染群体为主。轮状病毒基因组共有11个基因节段，分别编码 6种结构蛋白(vp1～4、vp6、vp7)和6种非结构蛋白(nsp1～6)，其中内核蛋白有3个(vp1～vp3)，内衣壳蛋白1个(vp6)，外壳蛋白2个(vp4和vp7)。根据vp6的抗原特异性可将rv分为(a-d and f-j)9个群，其中a群轮状病毒 (rva)的感染最为普遍。rva的分型是根据病毒外壳蛋白vp7和vp4的特异性和多样性划分的，根据vp7序列分为g血清型，根据vp4序列划分为p基因型。截至目前全球共发现36种g基因型和51种p基因型。流行病学研究表明，在全球人类感染rva的情况中至少有6种g基因型(g1-g4、g9、g12)和3 种p基因型(p[4]、p[6]、p[8])占主导地位。虽然对轮状病毒的研究有几十年的历史，疫苗的问世减少了死亡病例，但是至今尚未研究出特效治疗药，疫苗是控制轮状病毒腹泻、降低死亡率的最经济有效的手段，因此，轮状病毒疫苗成为世界卫生组织疫苗发展计划中的首要任务之一。目前上市的轮状病毒疫苗，例如五价口服轮状病毒疫苗，疫苗免疫原成分包括g1、g2、g3、g4和p[8]基因型，可以在儿童中诱导广泛的交叉保护性免疫应答。又如口服轮状病毒活疫苗((lanzhou lamb rotavirus vaccine，llr)，疫苗病毒株是从羊肠道分离，血清型为g10p[15] 型，其保护效力来自于种属交叉保护，研究表明，llr疫苗对人轮状病毒胃肠炎(rvge)的有效率为35.0％至73.3％。考虑到rvge负担和rv血清型的转变，研制替代的新型改良rv疫苗应该是有前景的。基于llr的口服人-羔羊重配三价(g2-g3-g4)疫苗(简称llr3)，已经完成了多中心、双盲、安慰剂对照的iii期临床试验，结果显示，在两个流行季节观察后，llr3的有效率分别为70.3％和56.6％，功效与商业化疫苗rotarix和rotateq相当，llr3还显示出对其他循环野生型，尤其是g9的交叉保护，但对g1的疗效仅为49.3％。

技术实现思路

1、本研究通过对此次临床试验中轮状病毒阳性粪样的分离培养和克隆纯化，分离了一株能在who许可的人用疫苗细胞基质vero细胞上稳定传代的g1p[8]型轮状病毒野毒株，命名为hn15d2毒株，可用于轮状病毒g1型重配病毒株的制备。

2、本发明的第一方面，提供了一种人轮状病毒hn15d2。

3、优选的，所述的人轮状病毒hn15d2已于2022年09月13日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址是：中国湖北省武汉市武昌区武汉大学保藏中心，保藏编号：cctcc no:v202278，分类命名为人g1型轮状病毒hn15d2株。

4、所述的人轮状病毒hn15d2的vp4基因如seq id no：1所示。

5、ggctttaaaatggcttcgctcatttatagacagcttctcactaattcata ttcagtagatttacatgatgaaatagagcaaattggatcagaaaaaactca aaatgtaactataaatccgagtccatttgcacagactagatatgctccagtc aattggggtcatggagagataaatgattcgactacagtaaaaccaatttta gatggtccttatcagccaactacatttactccacctaatgattattggatact tattaattcaaatacaaatggagtagtatatgaaagtacaaataatagtgac ttttggactgcagtcgttgctattgaaccgcacgttaacccagtagataga caatatacgatatttggtgaaagtaagcaatttaatgtgagtaacgattcaa ataaatggaagtttttagaaatgtttagaagcagtagtcaaaatgaatttta taatagacgtacattaacttctgatactagatttgtaggaatattgaaatatg gtggaagagtatggacatttcatggtgaaacaccaagagctactactgaca gttcaagtactgcaaatttaaataatatatcaattacaattcattcagaattt tacattattccaaggtcccaagaatctaaatgtaatgaatatattaataatgg tctgccaccaattcaaaatactagaaatgtagttccattgccattatcatcta gatcgatacagtataagagagcacaagttaatgaagacattatagtttcaa aaacttcattatggaaagaaatgcagtataatagggatattataattagattt aaatttggtaatagtattgtaaaaatgggaggactaggttataaatggtctg aaatatcatataaggcagcaaattatcaatataattacttacgtgacggtgaa caagtaaccgcacacaccacttgttcagtaaatggagtgaacaattttagc tataatggagggtttctacccactgattttggtatttcaaggtatgaagttat taaagagaattcctatgtatatgtagactattgggatgattcaaaagcattta gaaatatggtatatgttagatcattagcagctaatttgaattcagtgaaatgt acaggtggaagttataattttagtataccagtaggtgcatggccagtaatga atggtggcgctgtttcgttgcattttgccggagttacattatccacgcaatt tactgattttgtatcattgaattcactacgatttagatttagtttgacagttg atgaaccacctttctcaatattgagaacacgtacagtgaatttgtacggatt accagccgctaatccaaataatggaaatgaatactacgaaatatcaggaag gttttcactcatttatttagttccaactaatgatgattatcagactccaattat gaattcagtgacagtaagacaagatttagagcgccaacttactgatttgcg agaagaatttaactcattgtcacaagaaatagctatggcacaattgattgat ttagcactgttgcctctagatatgttttccatgttttcaggaattaaaagtac aattgatttaactaaatcaatggcgactagtgtaatgaagaaatttagaaaa tcaaaattagctacatcaatttcagaaatgactaattcattgtcagatgctg cttcatcagcatcaagaaacgtttctattagatcgaatttatctgcgatctca aattggactaatgtttcaaatgatgtgtcaaacgtaactaattcattgaacg atatttcaacacaaacgtctacaattagtaagaaacttagattaaaagaaat gattactcaaactgaaggaatgagctttgacgacatttcagcagctgtact aaaaacaaaaatagatatgtctactcaaattggaaaaaatactttacctga catagttacagaggcatctgagaaatttattccaaaacgatcatatcgaata ttaaaggatgatgaagtaatggaaattaatactgaaggaaaattctttgcat acaaaattaatacatttgatgaagtgccattcgatgtaaataaattcgctga actagtaacagattctccagttatatcagcgataatcgattttaagacattg aaaaatttaaatgataattatggaatcactcgtacagaagcgttaaatttaa ttaaatcgaatccaaatatgttgcgtaatttcattaatcaaaataatccaatt ataaggaatagaattgaacagttaatactacaatgtaaattgtgagaatgtc tagaggatgtgacct(seq id no：1)

6、所述的人轮状病毒hn15d2的vp7基因如seq id no：2所示。

7、ggctttaaaagagagaatttccgtctggctaacggttagctccttttaa tgtatggtattgaatataccacaattctaatctttttgatatcaatcattctac tcaactatatattaaaatcagtgactcgaataatggactacattatatatagat ttttgttgattactgtagcattatttgctttgacaagagctcagaattatgg acttaacttaccaataacaggatcaatggacgctgtatatactaactctact caagaagaagtgtttctaacttctacgttatgtctgtattatccaactgaag caagtactcaaatcaatgatggtgactggaaagactcattgtcgcaaatgt ttcttacaaagggttggccaacaggatctgtttactttaaagagtactcaa atattgttgatttttctgttgacccacagctgtattgtgactataatttagta cttatgaaatatgaccaaagtcttgaattagatatgtcagagttagctgattt aatattgaatgaatggttatgtaacccaatggatgtaacattatactattatc aacaatcgggagaatcaaataagtggatatcgatgggatcatcatgtaccgt gaaagtgtgtccgctaaatacacaaacgttagggataggttgtcaaacaac aaacgtagactcatttgaaatgattgctgagaatgagaaattagctatagt ggatgtcgttgatgggataaatcataaaataaatttaacaactacgacatgt actattcgaaattgtaagaaattaggtccaagagaaaatgtagctgtaata caagttggtggttctaatgtgttagacataacagcagatccaacaattaatc cacaaactgagagaatgatgagagtgaattggaaaaagtggtggcaagta ttttatactatagtagattatattaatcaaattgtacaggtaatgtccaaaag atcaagatcattaaattctgcagctttttattatagagtatagatatatcttag atcagaattgtatgatgtgacc(seq id no：2)

8、所述的人轮状病毒hn15d2的vp6基因如seq id no：13所示。

9、ggcttttaaacgaagtcttcgacatggaggttctgtactcactgtcaa gaactcttaaagatgctagggacaaaattgttgaaggtacattatattctaa tgttagcgatcttattcagcaattcaatcaaatgatagtaactatgaatgga aatgattttcagactggaggaattggtaatttacctattagaaattggactt tcgattttggtctattaggtacaacacttttgaacttggatgctaattatgtt gagaatgcaagaactataattgaatattttattgactttattgataatgtatg tatggatgaaatggcaagagaatctcaaagaaatggagtagcgccacaatc tgaagcgttgagaaagttagcgggaattaaatttaagagaataaatttcga taattcatcagaatacatagaaaattggaacttacaaaatagaagacagcg caccggatttgtttttcataaacctaacatatttccatactcagcttcatttactctaaatagatctcaaccaatgcatgataatttaatgggaaccatgtggct taatgctggatcagaaattcaagtggctggatttgactactcatgcgccata aatgcaccagcgaacatacagcaatttgaacatatcgtccagcttaggcgc gcactgactacagctactataactttattacctgatgcagagagatttagtt ttccaagagtaattaattcagctgatggcgcgactacatggttctttaatcc agttattctaagaccaaacaatgtagaggtagaatttttgttgaatggaca aattattaatacatatcaggctagatttggtactatcatcgcaagaaattttg atgcaattcgtttattatttcagttgatgcgtccacctaatatgacaccagct gttaatgcactgtttccacaagcacaaccttttcagcaccatgcaacagtt ggacttacattacgtattgaatctgcggtttgtgaatcagtgcttgcggacg caaatgaaactctgttagcaaatgtgaccgcggtgcgtcaagaatatgcca taccagttggaccggtatttccaccaggcatgaattggactgaattaattac taactattcgccatctagagaagataacttgcaacgcgttttcacggtagct tccattagaagcatgttgattaagtgaggaccagactaaacatctggtatcc aatcttagttagcatgtagctacatcaagtcattcagactcttcaagtaagg acatgatttcatgttcgctacgtagagtaactgtctgaatgatgtagtgaga ggatgtgacc(seq id no：13)

10、本发明的第二方面，提供了一种细胞。

11、优选的，所述的细胞包含上述的人轮状病毒hn15d2。

12、优选的，所述的细胞为ma-104细胞或vero细胞。

13、在本发明的一个具体实施方式中，所述的细胞为ma-104细胞。

14、在本发明的一个具体实施方式中，所述的细胞为vero细胞。

15、本发明的第三方面，提供了一种疫苗。

16、优选的，所述的疫苗包含上述的人轮状病毒hn15d2，和/或，上述的细胞。

17、优选的，所述的疫苗还包含免疫学上可接受的载体。

18、进一步优选的，所述的免疫学上可接受的载体包括但不限于佐剂、稀释剂、增溶剂、润滑剂、助悬剂、转染促进剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、促进吸收剂和/或增效剂中的一种或两种以上。

19、优选的，所述佐剂包括但不限于表面活性剂如免疫刺激复合物、弗氏完全佐剂(fca)或弗氏不完全佐剂(fia)、cpg、铝盐佐剂(氢氧化铝或者磷酸铝)、 lps类似物(例如单磷酰酯a)、胞壁肽、苯醌类似物、角鲨烯、透明质酸、脂质、脂质体、钙离子、病毒蛋白质、阳离子、聚阳离子(例如聚-l-谷氨酸(lgs))或纳米粒子、gm-csf、il-17、ifng、il-15、il-21、抗pd1/2、乳铁蛋白、鱼精蛋白、il-1、il-2、il-3、il-4、il-5、il-6、il-7、il-8、il-9、il-10、il-12、inf-α、 inf-γ、lymphotoxin-α、hgh、mcp-1、mip-1a、mip-1p、il-8、rantes、l- 选择蛋白、p-选择蛋白、e-选择蛋白、cd34、glycam-1、madcam-1、lfa-1、 vla-1、mac-1、pl50.95、pecam、icam-1、icam-2、icam-3、cd2、lfa-3、 m-csf、cd40、cd40l、血管生长因子、成纤维细胞生长因子、神经生长因子、血管内皮生长因子、apo-1、p55、wsl-1、dr3、tramp、apo-3、air、lard、 ngrf、dr4、dr5、killer、trail-r2、trick2、dr6、半胱天冬酶ice、 fos、c-jun、sp-1、ap-1、ap-2、p38、p65rel、myd88、irak、traf6、ikb、无活性的nik、sap k、sap-1、jnk、nfkb、bax、trail、trailrec、 trailrecdrc5、trail-r3、trail-r4、rank、rank ligand、 ox40、ox40ligand、nkg2d、mica、micb、nkg2a、nkg2b、nkg2c、 nkg2e、nkg2f、tap1、tap2以及其功能性片段。

20、在本发明的一个具体实施方式中，所示的佐剂为弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂。

21、本发明的第四方面，提供了一种人轮状病毒hn15d2病毒的培养方法。

22、优选的，所述的病毒为上述第一方面所述的的人轮状病毒hn15d2。

23、优选的，所述的培养方法包括将上述的人轮状病毒hn15d2接种至细胞中，培养细胞。

24、优选的，所述的细胞为ma-104细胞或vero细胞。

25、优选的，所述的培养方法包括：

26、1)将轮状病毒阳性粪便标本重悬、漩涡振荡、离心，获得样本悬液；

27、2)在1)获得的悬液中加入胰酶，水浴后接种至细胞中；

28、3)接种至细胞后吸附，弃上清后加入胰酶和培养基维持液；

29、4)在培养箱中培养，观察细胞形态和细胞病变；

30、优选的，步骤1)中还包含除菌过滤的步骤，所述的除菌过滤包括使用 0.20-0.25μm，例如0.20、0.21、0.22、0.23、0.24、0.25μm的滤器。

31、在本发明的一个具体实施方式中，所述的除菌过滤包括使用0.22μm的滤器。

32、优选的，步骤2)中所述的胰酶的初浓度为200-400μg/ml，例如200、210、 220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、 360、370、380、390、400μg/ml。

33、在本发明的一个具体实施方式中，步骤2)中所述的胰酶的初浓度为 300μg/ml。

34、优选的，步骤2)中所述的胰酶的终浓度为10-20μg/ml，例如10、11、12、 13、14、15、16、17、18、19、20μg/ml。

35、在本发明的一个具体实施方式中，步骤2)中所述的胰酶的终浓度为15μg/ml。

36、优选的，步骤2)中所述水浴的温度为35-40℃，例如35、36、37、38、39、 40℃；水浴的时间为50-70min，例如50、51、52、53、54、55、56、57、58、 59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70min。

37、在本发明的一个具体实施方式中，步骤2)中所述的水浴的温度为37℃；水浴的时间为60min。

38、优选的，步骤2)中所述的细胞为经过培养长至单层的ma-104细胞或vero 细胞；

39、优选的，步骤3)中所述的吸附的温度35-40℃，例如35、36、37、38、39、 40℃；吸附的时间为50-70min，例如50、51、52、53、54、55、56、57、58、 59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70min。

40、在本发明的一个具体实施方式中，所述的吸附的温度为37℃；吸附的时间为60min。

41、优选的，步骤3)中所述的胰酶的终浓度为0.3-0.7μg/ml，例如0.3、0.4、 0.5、0.6、0.7μg/ml。

42、在本发明的一个具体实施方式中，步骤3)中所述的胰酶的终浓度为0.5μg/ml。

43、优选的，步骤3)中所述的培养基维持液根据细胞的不同可能有所不同。

44、在本发明的一个具体实施方式中，所述的接种至细胞为接种至ma-104细胞，所述的培养基维持液为rpmi-1640。

45、在本发明的一个具体实施方式中，所述的接种至细胞为接种至vero细胞，所述的培养基维持液为mem。

46、优选的，步骤4)中所述培养箱的条件为35.0-37.0℃，例如35.0、35.5、36.0、36.5、37.0℃，3％-7％，例如3％、4％、5％、6％、7％ co2

47、在本发明的一个具体实施方式中，步骤4)中所述培养箱的条件为36.5℃， 5％co2。

48、在本发明的一个具体实施方式中，所述的培养方法包括：

49、1)将轮状病毒阳性粪便标本用pbs重悬、漩涡振荡、离心，上清液用0.22μm 滤器除菌过滤，获得样本悬液；

50、2)在步骤1)获得的样本悬液中加入300μg/ml胰酶(终浓度15μg/ml)， 37.0℃水浴60min，接种至长至单层的ma-104细胞或vero细胞；

51、3)接种后置于37.0℃吸附60min，弃上清后加入胰酶(终浓度15μg/ml) 和培养基维持液，置于36.0℃、5％ co2的培养箱中培养，观察细胞形态和细胞病变。

52、在本发明的一个具体实施方式中，所述的接种至细胞为接种至ma-104细胞，所述的培养基维持液为rpmi-1640。

53、在本发明的一个具体实施方式中，所述的接种至细胞为接种至vero细胞，所述的培养基维持液为mem。

54、本发明的第五方面，提供了一种细胞的制备方法。

55、优选的，所述的细胞为上述第二方面的细胞。

56、优选的，所述的制备方法包括将上述的人轮状病毒hn15d2接种至细胞中。

57、优选的，所述的细胞为ma-104细胞或vero细胞。

58、本发明的第六方面，提供了一种疫苗的制备方法。

59、优选的，所述的疫苗为上述第三方面所述的疫苗。

60、优选的，所述的制备方法包括将上述的人轮状病毒hn15d2接种至细胞中培养，浓缩，然后灭活。

61、优选的，所述的细胞为ma-104细胞或vero细胞。

62、优选的，还包括加入免疫学上可接受的载体的步骤。

63、优选的，所述的灭活包括使用甲醛。

64、优选的，所述的制备方法包括：

65、1)将上述的人轮状病毒hn15d2接种至ma-104细胞中，纯化后进行vero 细胞适应性培养，浓缩；

66、2)浓缩后加入甲醛溶液，混匀后水浴振荡灭活；

67、3)加入亚硫酸氢钠中和剩余甲醛；

68、4)加入佐剂。

69、优选的，步骤1)中所述的纯化包括空斑法纯化。

70、优选的，步骤1)中还包含除菌过滤的步骤，所述的除菌过滤包括使用 0.20-0.25μm，例如0.20、0.21、0.22、0.23、0.24、0.25μm的滤器。

71、优选的，所述1)中的甲醛溶液为40％甲醛溶液，所述的甲醛溶液的终浓度为0.1％。

72、优选的，所述的2)中水浴振荡灭活包括：

73、a)50-65℃，例如50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、 62、63、64、65℃，优选为60℃水浴振荡20-40min，例如20、21、22、23、24、 25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40min，优选为30min；

74、b)然后，置于35-40℃，例如35、36、37、38、39、40℃，优选为37℃水浴振荡70-75h，例如70、71、72、73、74、75h，优选为72h灭活。

75、优选的，步骤4)之前还包含稀释的过程，具体的，通过mem稀释蛋白至 200μg/ml。

76、优选的，步骤4)中所述的佐剂包括弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、cpg、铝盐佐剂。

77、在本发明的一个具体实施方式中，所述的制备方法包括：

78、1)将上述的人轮状病毒hn15d2接种至ma-104细胞中，空斑法纯化后进行vero细胞适应性培养，浓缩至100倍体积后用0.22μm滤器除菌过滤；

79、2)加入40％甲醛溶液，混匀使其终浓度为0.1％，然后经过60℃水浴振荡 30min后，置于37℃水浴振荡72h灭活，获得灭活后的病毒液；

80、3)在灭活后的病毒液加入亚硫酸氢钠中和剩余甲醛，然后利用mem稀释蛋白浓度至200μg/ml，获得轮状病毒疫苗原液；

81、4)加入佐剂。优选的，所述的疫苗根据针剂的次数不同，添加的佐剂不同。

82、根据本技术的一个具体实施方式，进行动物免疫时，第1剂按(0.5-2)：(0.5-2) 例如0.5：1、0.5：2、1：1、1：1.5、1：2、2：1、1：1.5、1：0.5、2：0.5、2： 1的比例分别加入灭活病毒原液和弗氏完全佐剂，第2剂和第3剂按(0.5-2)： (0.5-2)例如0.5：1、0.5：2、1：1、1：1.5、1：2、2：1、1：1.5、1：0.5、2： 0.5、2：1的比例混合灭活病毒原液和弗氏不完全佐剂。

83、在本发明的一个具体实施方式中，进行动物免疫时，第1剂按1：1的比例分别加入灭活病毒原液和弗氏完全佐剂，第2剂和第3剂按1：1的比例混合灭活病毒原液和弗氏不完全佐剂。

84、本发明的第七方面，提供了一种上述的人轮状病毒hn15d2毒株、上述的细胞、上述的疫苗、上述培养方法获得的病毒、上述制备方法获得的细胞、上述制备方法获得的疫苗在制备预防和/或治疗疾病的产品中的应用。

85、优选的，所述的疾病包括但不限于轮状病毒相关疾病。

86、进一步优选的，所述的轮状病毒相关疾病包括但不限于急性胃肠炎、腹泻、新生儿坏死性小肠炎、婴儿肠套叠、肺炎、脑炎、脑膜炎、突发性婴儿死亡综合征、雷耶综合征、溶血性尿毒综合征、川崎病和克罗恩病。

87、本发明术语“包括”或“包含”是开放式的描述，含有所描述的指定成分或步骤，以及不会实质上影响的其他指定成分或步骤。

88、本发明所述的“和/或”包含该术语所连接的项目的所有组合，应视为各个组合已经单独地在本文列出。例如，“a和/或b”包含了“a”、“a和b”以及“b”。又例如，“a、b和/或c”包含了“a”、“b”、“c”、“a和b”、“a和c”、“b和c”以及“a和b和c”。