一种产2,3-丁二醇的工程菌及其构建方法与应用与流程

本发明属于生物工程，涉及一种产2,3-丁二醇的工程菌及其构建方法与应用。

背景技术：

1、2,3-丁二醇(bdo)又称二甲基乙二醇，其分子量为90.121(g/mol)，分子式为c4h10o2。bdo有3种异构体，这三种异构体的沸点略有不同，在177～182℃之间，但都远高于水的沸点。bdo可以转化为2,3-丁二烯，可以用来进一步合成橡胶。此外由于bdo的冰点为-60℃，所以也可用作防冻液。bdo或其衍生物已在塑料和溶剂生产中得到应用。bdo的脱氢产物是双乙酰，具有黄油的味道，可作为食品中价值很高的调味剂。bdo脱水得到甲基乙基酮(mek；丁烷-2-酮)，是一种高效的燃料添加剂，燃烧热比乙醇高。其次，bdo(2,719,8j/g)能与其他液体燃料如甲醇(2,208,1j/g)和乙醇(2,905,5j/g)的热值相匹配。等摩尔乙醇和bdo的混合物可以提供27660j/g的综合热值，而且乙醇的存在并不影响bdo的使用。bdo由于其高辛烷值，可以作为石油的“辛烷值增强剂”。bdo酯化的其他产品主要用于医药和化妆品等领域。bdo的进一步潜在应用包括：印刷油墨、香水、熏蒸剂、氨纶、润湿和软化剂、增塑剂(如硝酸纤维素、聚氯乙烯、聚丙烯酸酯)和医药载体。由此可见，bdo是一种具有高附加值的新兴能源化合物，广泛应用于航空航天、食品、医药等领域，是工业上广泛使用的重要平台化合物。

2、bdo是一种可以通过生物技术途径生产的化学品。对bdo生物合成的研究始于1906年，当时harden和walpole利用klebsiella pneumoniae生产这种化合物。但是klebsiellapneumoniae不仅具有致病性，而且其遗传背景尚不清楚。之后，人们将目光转向了遗传背景清楚、基因操作工具丰富的大肠杆菌和酿酒酵母等微生物。因此如何利用模式微生物进行分子生物学的操作，实现bdo产量的进一步提升就变得尤为关键。

技术实现思路

1、本发明的目的是提高大肠杆菌中bdo的产量并且不影响大肠杆菌的正常生长。

2、本发明的发明人先利用pacycduet1载体和诱导型lac启动子表达了来源于地衣芽孢杆菌(bacillus licheniformis)的buda和budb基因以及来源于粘质沙雷氏菌(serratiamarcescens)的budc基因，通过诱导表达检测到2,3-丁二醇的产量仅为0.25g/l；之后，将lac启动子替换为t7启动子，通过表达检测到2,3-丁二醇的产量为0.8g/l；最后分别用tet组成型启动子、m1-δ37-5组成型启动子和t7组成型启动子启动budb、buda和budc三个基因，2,3-丁二醇的产量达到了2.53g/l，提高了9倍，且重组大肠杆菌的生长并未受到影响，最后在5l发酵罐中通过流加补糖的方式，2,3-丁二醇的产量达到了58.9g/l。

3、2,3-丁二醇在重组大肠杆菌中的生物合成途径如图1所示。

4、在第一个方面，本发明提供一种生产2,3-丁二醇的工程菌的构建方法，其是以大肠杆菌bl21(de3)为宿主菌，在其中转入重组表达载体，以表达来源于地衣芽孢杆菌(bacillus licheniformis)的buda和budb基因以及来源于粘质沙雷氏菌(serratiamarcescens)的budc基因；

5、其中，所述budb、buda和budc基因分别由tet组成型启动子、m1-δ37-5组成型启动子和t7组成型启动子启动；

6、所述m1-δ37-5组成型启动子的序列如seq id no:20所示；

7、所述tet组成型启动子如seq id no:28中第16-44位所示；

8、所述t7组成型启动子如seq id no:13中第16-34位所示。

9、在一些实施方案中，上述方法中，所述budb基因的序列如seq id no:28中第45-1763位所示，其编码的乙酰乳酸合成酶的氨基酸序列如seq id no:2所示。

10、在一些实施方案中，上述任一所述的方法中，所述buda基因的序列如seq id no:34中第21-800位所示，其编码的乙酰乳酸脱羧酶的氨基酸序列如seq id no:6所示。

11、在一些实施方案中，上述任一所述的方法中，所述budc基因的序列如seq id no:31中第18-815位所示，其编码的乙偶姻脱氢酶的氨基酸序列如seq id no:10所示。

12、在一些实施方案中，上述任一所述的方法中，所述重组表达载体为pacycduet1-ptet-budb-pm1-δ37-5-buda-pt7-budc，其可以通过如下方法构建：ncoⅰ以及avrⅱ双酶切pacycduet1质粒，得到载体骨架，将载体骨架与ptet-budb片段、pt7-budc片段和buda片段以及m1-δ37-5组成型启动子进行gibson连接得到；

13、其中，所述ptet-budb片段如seq id no:28所示；

14、所述pt7-budc片段如seq id no:31所示；

15、所述buda片段如seq id no:34所示；

16、所述m1-δ37-5组成型启动子如seq id no:20所示；

17、所述pacycduet1-ptet-budb-pm1-δ37-5-buda-pt7-budc质粒中，ptet-budb-pm1-δ37-5-buda-pt7-budc片段的序列如seq id no:37所示。

18、在第二个方面，本发明提供由上述任一所述的方法构建得到的工程菌，具体为de3-7，其是将所述重组表达载体pacycduet1-ptet-budb-pm1-δ37-5-buda-pt7-budc转入大肠杆菌bl21(de3)中得到的。

19、在第三个方面，本发明提供上述工程菌在生产2,3-丁二醇中的应用。

20、在第四个方面，本发明提供一种生产2,3-丁二醇的方法，包括发酵培养上述工程菌的步骤。

21、在一些实施方案中，上述生产方法中，所述发酵培养的条件为：利用氨水控制ph值为6-8；转速为150-250rpm，优选170rpm；温度控制在35-40℃，优选37℃；空气流速为0.5-2l/h，优选1.5l/h；发酵15-20h，优选18h后，按照每升培养基补加0.1-0.3g葡萄糖的量每120s补加葡萄糖，优选按照每升培养基补加0.2g葡萄糖的量每120s补加葡萄糖。

22、在一些实施方案中，上述任一所述的生产方法中，所述发酵时使用的发酵培养基的成分为15-17g/l na2hpo4，10-20g/l kh2po4，0.5-2nh4cl，0.1-0.8g/l nacl，9.6-38.4g/l葡萄糖。

23、在一些实施方案中，上述任一所述的生产方法中，发酵液初始od600为0.1-0.5，优选od600为0.3；发酵24-72h。

24、本发明的有益效果是：通过表达外源bdo合成途径中三个酶，并通过不同强度的启动子分别对α-乙酰乳酸合成酶、α-乙酰乳酸脱羧酶和乙偶姻脱氢酶进行调控，使得摇瓶发酵2,3-丁二醇的产量提高了9倍以上，达到了2.53g/l，并且重组大肠杆菌在48h后od600达到了3.6以上，生长并未受到影响，最后在5l发酵罐中通过流加补糖的方式，2,3-丁二醇的产量达到了58.9g/l。