一种肝素酶突变体H2-15及其工程菌株和应用

本发明属于蛋白突变，具体涉及一种肝素酶突变体h2-15及其工程菌株和应用。

背景技术：

1、1922年howell从动物肝脏中提取分离出来一种糖类物质，并正式将其命名为肝素[1](unfractionated heparin，ufh)，肝素是由艾杜糖醛酸和葡萄糖醛酸组成的硫酸氨基葡聚糖[2]，属于粘多糖类，分子量在14000da左右，它具有抗凝血、抗血栓等功能[3]，而且是我国目前出口量最大的药物原料药之一。自1935年起肝素就在临床上用于预防和治疗血栓栓塞症[4]。但由于肝素容易在治疗过程中引发低血压和休克[5]，所以研究者应需求研发出新型抗凝血药物——小分子肝素(low molecular weight heparin，lmwh)，它与未分离肝素相比，平均分子量更小，在5000da左右，更重要的是其抗血栓作用优于肝素，且具有皮下注射吸收好，生物利用度较高，体内半衰期长，出血倾向小等优点[6]。在全球肝素系列产品中，仅三分之一的肝素原料药被制成标准肝素药剂，而三分之二的肝素作为原材料用于生产低分子肝素或超低分子肝素，低分子肝素市场销售量逐年上升[7]。现阶段还在进行新的更低分子量的肝素研发——超低分子量肝素(ultra low molecular weight heparin，ulmwh)，分子量在2500da以下[8]，其抗凝血效果比前两者更好，引起并发症的可能性更低。因此，超低分子量肝素成为了新一轮抗凝血药物研发的热点。

2、现有的低分子肝素制备方法有化学解聚法、物理制备法以及生物酶法，其中化学解聚法主要用亚硝酸盐使得肝素糖苷键发生断裂；物理制备法主要用超声波降解[9]，但无论化学法还是物理法都普遍存在制备费用高、效率较低、生产成本高昂、降解过程可控性差、易损伤的药物功能结构肝素活性功能团、产物间均一性差、(制造过程中试剂易残留)易出现在制造过程中试剂的残留等问题。相对而言，以生物酶法制备低分子肝素可避免环境污染问题，收率较高，故使用肝素酶制备小分子肝素的酶法降解技术是当前制备小分子肝素的领域热点。如今，肝素酶裂解法生产肝素类药物需要解决的关键问题是如何提高肝素酶的酶活。

3、参考文献

4、[1]wardrop d，keeling d.the story of the discovery of heparin andwarfarin[j].british joumal of haematology，2008，141(6)：757-763.

5、[2]jaques lb，cho m h.the preparation of heparinase[j].the biochemicaljournal，1954，58(2)：25-26.

6、[3]jordan r e，oosta g m，gardner w t，et al.the kinetics of hemostaticenzyme-antithrombin interactions in the presence of low molecular weightheparin[j].the journal of biological chemistry，1980，255(21)：81-90.

7、[4]vineeta s，shafiul h，vibha k，et a1.isolation，purification，andcharacterization of heparinase from streptomyces variabilis mtcc12266[j].scientific reports，2019，9(1)：6482.

8、[5]yilmazel u e，metin a，omer a，et a1.comparison of lmwh versus ufhforhemorrhage and hospital mortality in the treatment of acute massive pulmonarythromboembolism after thrombolytic treatment：randomized controlled parallelgroup study[j].lung，2015，193(1)：121-127.

9、[6]何月月.依诺肝素钠工艺研究[d].河北科技大学，2020.

10、[7]任永海，李晓燕，黄磊，等.重组肝素酶i在大肠杆菌中的表达及纯化[j].药物生物技术，2012，19(05)：377-380.

11、[8]tolga g，zubeyde a p，eyup y，et al.effects of low molecular weightheparins and unfractionated heparin on viability of human umbilical veinendothelial cells[j].archives of gynecology and obstetrics，2013，287(2)：217-222.

12、[9]miyazaki t，yomota c，okada s.ultrasonic depolymerization ofhyaluronic acid[j].polymer degradation and stability，2001，74(1)：77-85.

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明的目的在于提供一种肝素酶突变体h2-15，在分子生物学层面对肝素酶的基因进行随机突变，筛选的得到酶活显著提高的肝素酶突变体，比野生型肝素酶的酶活提高了112.1％以上。

2、本发明提供了一种肝素酶突变体h2-15，所述肝素酶突变体在野生型肝素酶氨基酸序列seq id no：1的基础上进行了以下突变：p10r、v45a、c113s、l135p、l160p、r166c和r218g。

3、优选的，氨基酸序列如seq id no：2所示。

4、本发明提供了一种所述肝素酶突变体h2-15的编码基因，所述编码基因的核苷酸序列如seq id no：3所示。

5、本发明提供了一种重组载体，在骨架载体上插入有所述编码基因或编码所述肝素酶突变体h2-15的核苷酸序列。

6、本发明提供了一种重组表达所述肝素酶突变体的工程菌株，包含编码所述肝素酶突变体h2-15的序列、所述编码基因或所述重组载体。

7、本发明提供了一种固定化酶，以海藻酸钙凝胶为载体，对所述肝素酶突变体h2-15固定。

8、本发明提供了一种所述固定化酶的制备方法，包括以下步骤：

9、1)将所述肝素酶突变体h2-15进行重组表达，得到含肝素酶突变体重组蛋白的溶液；

10、2)将所述含肝素酶突变体重组蛋白的溶液与海藻酸钠溶液混合，得到的混合液滴入cacl2溶液中，冷却固化，得到固定化酶。

11、优选的，步骤1)中所述重组表达的方法为将权利要求5所述工程菌株在含抗生素的培养基中培养，在0.1mmol/l iptg条件下诱导表达，裂解菌体，收集上清液。

12、优选的，步骤2)中所述含肝素酶突变体重组蛋白的溶液与海藻酸钠溶液的体积比为0.8～1.2：1；

13、所述海藻酸钠溶液的质量百分含量为8％；

14、所述cacl2溶液的浓度为0.1mol/l。

15、本发明提供了所述肝素酶突变体h2-15、所述工程菌株或所述固定化酶在催化生产肝素中的应用。

16、本发明提供了一种肝素酶突变体h2-15，是在野生型肝素酶氨基酸序列seq idno：1的基础上进行了以下突变：p10r、v45a、c113s、l135p、l160p、r166c和r218g。本发明对来源于拉乌尔菌属(raoultella sp.)的肝素酶基因采用ceppcr与megawhoppcr结合的易错pcr技术进行随机突变，高通量筛选获得高酶活的肝素酶突变体。实验结果表明，重组表达的肝素酶突变体菌株的酶活为4000u/l以上，而野生型菌株酶活仅为1886u/l，本发明提供的肝素酶突变体比野生型肝素酶酶活提高了112.1％以上，具有较高的应用价值。

17、本发明提供了一种固定化酶，以海藻酸钙凝胶为载体，对所述肝素酶突变体h2-15固定。所述固定化酶比游离肝素酶对温度稳定性和ph值的稳定性以及贮藏稳定性方面均有提高，为催化生产肝素提供了良好的催化剂，具有较高应用价值。