两个二苯醚化合物及其制备方法和在制备抗菌药物中的应用

：
1.本发明属于天然产物领域，具体涉及两个二苯醚化合物及其制备方法和在制备抗菌药物中的应用。


背景技术：

2.微生物天然产物一直是抗感染药物的重要来源，据统计，目前临床使用的抗生素中，有70％均来源于微生物天然产物及其衍生物，对维护人类机体健康，延长人类平均寿命做出了突出贡献(山东大学学报(医学版),2021,59(09):43-50)。然而近年来伴随着抗生素的大量使用，导致环境中出现了许多对临床使用抗生素具有抗性的“超级细菌”，使人类再次面临日益严重的感染危机，2016年《全球抗菌素耐药回顾》指出，预计到2050年每年会有1000万人死于耐药菌感染(archives of pharmacy practice,2016,7:110.)。面对新的危机，除了管控抗生素的使用以减缓耐药菌的出现外，开发具有新颖抗菌机制的新型抗生素也尤为重要。
3.按照来源不同，二苯醚类化合物可分为化学合成及天然来源两类，在农药，医药及日化产品领域均有广泛应用。例如常用的除草剂除草醚(2,4-二氯苯氧基硝基苯)，氟磺胺草醚，以及抗菌剂三氯新等均为二苯醚类化合物。相比于化学合成类二苯醚化合物，天然来源二苯醚数量较少，但均有较好的抗菌、抗肿瘤、抗病毒或抗炎等生物活性(chemical and pharmaceutical bulletin,2007,55:304-307；the journal of antibiotics,2013,66:539-542.)。本专利发明者在研究一株海洋来源真菌spiromastix.sp发酵产物过程中，利用硅胶柱层析、高效液相色谱等技术分离获得两个二苯醚类新化合物。mic抗菌活性结果显示两个化合物具有较好的抗g
+
菌活性，提示化合物1，2具有进一步开发成新型广谱抗g
+
菌抗生素药物的潜力。


技术实现要素：

4.本发明的目的之一是提供两个具有抑菌活性的二苯醚类新化合物spiromastol l(1)，spiromastol m(2)。
[0005][0006]
本发明的目的之二是提供海洋真菌spiromastix.sp scsio f190在制备化合物spiromastol l(1)，spiromastol m(2)中的应用。
[0007]
本发明的目的之三是提供化合物spiromastol l(1)，spiromastol m(2)的制备方法，所述的化合物spiromastol l(1)，spiromastol m(2)是从海洋真菌spiromastix.sp scsio f190的发酵培养物中分离得到的。
[0008]
按照本发明，优选所述的spiromastol l(1)，spiromastol m(2)是从海洋真菌spiromastix.sp scsio f190的发酵培养物中分离得到的，具体步骤如下：
[0009]
a、制备海洋真菌spiromastix.sp scsio f190的发酵培养物，固液分离得上清发酵液和沉淀菌丝体，上清发酵液用丁酮萃取，丁酮萃取液减压浓缩得上清发酵液浸膏；沉淀菌丝体用丙酮萃取，丙酮萃取液减压浓缩得菌体浸膏，合并上清发酵液浸膏和菌体浸膏；
[0010]
b、浸膏用正相硅胶色谱柱，氯仿-甲醇从体积比100:0,98:2,96:4,94:6,92:8,90:10,80:20,50:50梯度洗脱，收取氯仿-甲醇体积比100：0,98：2洗脱的组分a1-a2，将组分a1-a2合并后采用石油醚/乙酸乙酯从体积比9:1,8:2,7:3,6:4,5:5,4:6,3:7,2:8,1:9梯度洗脱，收集石油醚/乙酸乙酯体积比6:4,5:5，3:7洗脱的组分b4、b5、b7，b7组分经纯化获得spiromastol m，组分b4、b5合并后经纯化后获得spiromastol l。
[0011]
优选，所述的海洋真菌spiromastix.sp scsio f190的发酵培养物是通过以下方法制备：
[0012]
a：将菌株spiromastix.sp scsio f190划线至pda固体培养基平板上培养至产孢，随后将孢子接入到液体种子培养基中，以200rpm的转速、在28℃下、摇床培养4天得种子培养液；
[0013]
b：在无菌条件下，将培养好的种子培养液分别接种于放大发酵培养基中，以200rpm的转速、在28℃下、摇床培养7天得海洋真菌spiromastix.sp scsio f190的发酵培养物；
[0014]
所述的种子培养基和放大发酵培养基是pdb培养基。
[0015]
本发明的目的之四是提供化合物spiromastol l(1)，spiromastol m(2)，或其药用盐在制备抗菌药物中的应用。
[0016]
一种抗菌药物，其特征在于，包括有效量的上述化合物spiromastol l(1)，spiromastol m(2)，或其药用盐，和药学上可以接受的载体。
[0017]
所述的抗菌药物优选为抗枯草芽孢杆菌、藤黄微球菌、粪肠球菌、屎肠球菌、金黄色葡萄球菌或耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的药物。
[0018]
本发明的二苯醚类化合物-spiromastol l(1)，spiromastol m(2)是新的化合物，对测试细菌具有较好的抑制作用，可以用于制备抗感染药物，用于治疗细菌感染，因此本发明为开发新的抗感染药物提供了备选化合物，对开发中国海洋药物资源具有重要的意义。
[0019]
本发明的海洋真菌spiromastix.sp scsio f190已于2019年9月19日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(gdmcc),地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，其保藏编号为：gdmcc 60747，该菌株公开于专利申请号cn201911009854.5，发明名称一种海洋真菌-细菌共生体及其代谢产物和在制备抗菌药物中的应用的专利中。
附图说明：
[0020]
图1是化合物1的1h nmr(700mhz)图谱，溶剂为：氘代氯仿；
[0021]
图2是化合物1的
13
c nmr(700mhz)图谱，溶剂为：氘代氯仿；
[0022]
图3是化合物2的1h nmr(700mhz)图谱，溶剂为：氘代甲醇；
[0023]
图4是化合物2的
13
c nmr(700mhz)图谱，溶剂为：氘代甲醇；
[0024]
图5是化合物2x-射线单晶衍射图谱。
具体实施方式：
[0025]
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
[0026]
实施例1：
[0027]
一、如式(ⅰ)所示的化合物1和化合物2的制备和结构鉴定
[0028]
1、种子培养
[0029]
(1)种子培养基配方(pdb培养基)：按照24g/l比例将pdb培养基溶解至水中，充分混匀后以每瓶100ml分装于250ml的锥形瓶中，于121℃灭菌20分钟，做为种子培养基。
[0030]
(2)种子的培养：将菌株spiromastix.sp scsio f190划线至pda固体培养基平板上培养14天产孢，随后将孢子接入到上述液体种子培养基中，以200rpm的转速、在28℃下、摇床培养4天得种子培养液。
[0031]
2、放大发酵培养
[0032]
(1)放大发酵培养基配方：按照24g/l比例将pdb培养基溶解至水中，充分混匀后以每瓶200ml分装于1000ml的锥形瓶中，于121℃灭菌20分钟，作为放大发酵培养基。
[0033]
(2)放大发酵培养：在无菌条件下，将培养好的种子培养液分别接种于放大发酵培养基中，每1000ml锥形瓶(含约200ml放大发酵培养基)接种50ml种子培养液，以200rpm的转速、在28℃下、摇床培养7天得海洋真菌spiromastix.sp scsio f190发酵液。
[0034]
3、提取分离
[0035]
发酵培养物的萃取：将结束发酵的spiromastix.sp scsio f190菌株的发酵液，以3900rpm离心10min，得上清发酵液和沉淀菌丝体。上清发酵液用丁酮等体积萃取5次，丁酮萃取液37℃减压浓缩得发酵液浸膏；沉淀菌丝体用2l丙酮萃取五次，丙酮萃取液在37℃下减压浓缩得菌体浸膏；hplc-dad检测结果显示菌液、菌体萃取产物相同，因而合并发酵液浸膏和菌体浸膏共计得约70g浸膏。
[0036]
化合物分离：浸膏用100-200目硅胶分离，经拌样、干法装柱后，采用氯仿/甲醇(c/m,100:0,98:2,96:4,94:6,92:8,90:10,80:20,50:50,v/v,500ml)梯度洗脱顺序得8个组分(a1-a8)。将组分a1-a2合并后采用石油醚/乙酸乙酯(p/e,9:1,8:2,7:3,6:4,5:5,4:6,3:7,2:8,1:9,v/v,500ml)梯度洗脱顺序得9个组分(b1-b9)。对组分b7高效液相半制备柱层析，mecn/h2o/hac洗脱(2/98/0.01
→
20/80/0.01，v/v，0
→
25min，λ＝254nm，流速为2.5ml/min)，tr＝25min得到化合物2(50mg，tr＝25min)。将b4-b5组分合并，反相ods中压柱层析(10mm
×
250mm，5mm，ods 40-63μm ymc)ch3cn/h2o洗脱(5/95
→
100/0，0
→
120min，流速为15ml/min)，根据体积，每150ml为一个组分，共获得12个组分(c1-c12)。组分c5、c6合并，高效液相半制备柱层析，mecn/h2o/hac洗脱(2/98/0.01
→
20/80/0.01，0
→
25min，λ＝254nm，流速为2.5ml/min)，得到化合物1(15mg，tr＝18min)。
[0037]
4、化合物1和化合物2的理化数据
[0038]
图1是化合物1的1h nmr(700mhz)图谱，溶剂为：氘代氯仿；图2是化合物1的
13
c nmr(700mhz)图谱，溶剂为：氘代氯仿；图3是化合物2的1h nmr(700mhz)图谱，溶剂为：氘代甲醇；图4是化合物2的
13
c nmr(700mhz)图谱，溶剂为：氘代甲醇；图5是化合物2x-射线单晶衍射图谱。
[0039]
化合物1和2理化性质数据如下：
[0040]
化合物1：白色无定形粉末；+1.0(c 0.10,meoh)；uv(meoh)λ
max
(logε)287(3.58),217(4.38)nm；ir(film)ν
max 3741,3415,2692,1647,1573,1423,1346,1234,1103,1045,754cm
–1；1h and 13
c nmr data,表1；hresims m/z 451.0054[m-h]-(calcd for c
19h19
cl4o4,451.0043).
[0041]
化合物2：白色无定形粉末；+9.1(c 0.10,meoh)；uv(meoh)λ
max
(logε)299(3.34),222(3.75),204(3.87)nm；ir(film)ν
max 3429,2964,1705,1573,1479,1433,1346,1240,1122,835cm
–1；1h and 13
c nmr data,表1；hresims m/z 459.0180[m-h]-(calcd for c
20h18
cl3o6,459.0174)。
[0042]
表1.化合物1，2的1h和
13
c(700mhz)nmr核磁数据
[0043]
[0044][0045]
通过对化合物的hresims、x射线单晶衍射、核磁共振数据分析，化合物1、2均为新化合物，结构如式i所示：
[0046][0047][0048]
将化合物1命名为spiromastol l，化合物2命名为spiromastol m。
[0049]
实施例2：
[0050]
对实施例1的二苯醚类化合物1和2的抑菌实验。
[0051]
以枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis bs01)、藤黄微球菌(micrococcus luteus ml01)、粪肠球菌(enterococcus faecalis atcc 29212、36950)、屎肠球菌(enterococcus faecium 35682、36711)、金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus atcc 29213)或耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(mrsa 991、mrsa 1862)等作为测试细菌，参照clsi的微孔板法对化合物1-2进行100μl体系测试活性。具体为：
[0052]
细菌培养：以lb肉汤培养基培养实验菌，当其生长8-12h至约0.5个mcfarland浓度(1
×
108cfu)时备用。并配置好一定浓度的样品溶液和阳性对照溶液，阳性对照选用氨苄西林、万古霉素两种(dmso溶)。
[0053]
配置样品与稀释菌液：将样品(化合物1、2)配置成3200μg/ml，均以dmso溶解。将菌液合理稀释，保证最终测试浓度约为5
×
104cfu。
[0054]
加lb肉汤：用排枪往96孔板中加lb肉汤，第1列加92μl、第12列加100μl无菌lb肉汤，其余各列加入50μl无菌mh肉汤，第11列和第12列分别作为阳性和阴性对照。
[0055]
加样品(药品)：吸取8μl事先配好的样品溶液或阳性对照溶液(也以dmso溶解)，加入第1列。将排枪体积设置为50μl，将第1列的测试药物小心上下吸取4-5次，以混合均匀，期间要防止用力过猛溅出。
[0056]
混匀样品(药品)：用排枪从第一列中吸取50μl，加入到对应的第二列中，上下吸取小心4-5次，混匀后再吸取50μl加入第三排。依次类推，直到稀释至第10列，从第10列中取出50μl弃掉。
[0057]
活性测试：向1-11列每孔加入50μl稀释的实验菌液。此时，第1列至第10列药物浓度分别为128，64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25μg/ml。盖上盖子，轻微震荡，置于37℃培养箱培养12-18小时，第11列做阳性对照，第12列做空白对照，确定出每个样品的mic值。每个样品做3个平行。
[0058]
实验结果见表2。
[0059]
活性测试结果表明，化合物spiromastol l(1)，spiromastol m(2)对枯草芽孢杆菌、藤黄微球菌、粪肠球菌、屎肠球菌、金黄色葡萄球菌及耐甲氧西林金黄色葡萄球菌具有较好的抑制作用。
[0060]
表2：化合物1-2对21株测试细菌的mic值(μg/ml)
[0061][0062]