酶法制备生物柴油的方法

1.本发明属于油脂化工技术领域，具体地说，本发明涉及一种两步酶法制备的生物柴油的方法。


背景技术：

2.生物柴油是一种新型柴油燃料，由生物油脂原料与甲醇或乙醇等小分子醇发生酯交换反应后，生成的一类长链脂肪酸酯类，其分子量与柴油接近，具有接近于石化柴油的理化性质。生物柴油溶解能力强、毒性低、易生物降解，适合在敏感的生态环境下使用，与传统石化柴油相比，其燃烧后的排放出的尾气中有害物质和颗粒物减少了一半，因此生物柴油是一种对环境友好的优质清洁能源。
3.生物柴油的制备方法包括化学法、物理法和生物酶法，其中主要应用于工业生产的是化学法，该方法虽然能够在短时间内达到较好的催化效果，但是存在对原料要求较高、造成反应设备的腐蚀、产生大量废水等问题。而生物酶法的反应条件温和、无污染物排放，符合经济和环境的可持续发展要求，是一种可以完全取代化学法生产生物柴油的绿色工艺，因此人们逐渐重视并采用该方法来制备生物柴油。
4.目前用于催化制备生物柴油的脂肪酶包括液体脂肪酶和固定化脂肪酶，液体脂肪酶虽然价格低廉、经济成本小，但容易失活、稳定性差；固定化脂肪酶稳定性高、可重复使用，但价格昂贵。现在工业上酶法制备生物柴油，一般采用酶法与化学法相结合，先酶法催化，再用化学法降低酸价。无论是使用液体酶催化还是固定化脂肪酶催化都会存在酸价不够低、转化率不够高的缺陷，因此需要更加完善的酶法工艺制备生物柴油。


技术实现要素：

5.基于此，本发明的目的之一在于提供一种酶法制备生物柴油的方法，该制备方法是利用液体脂肪酶和固定化脂肪酶，两步催化制备生物柴油，转化率高、酸价低。
6.实现上述发明目的的具体技术方案包括如下：
7.一种酶法制备生物柴油的方法，包括以下步骤：
8.(1)、在反应器中加入原料油、液体脂肪酶和短链醇，20℃～45℃，反应4h～18h；所述液体脂肪酶的重量为原料油重量的0.2％～5％；所述短链醇与原料油的摩尔比为(0.5～4)：1；
9.(2)、停止反应，将反应液分离，得到油相和水相；
10.(3)、在油相中加入固定化脂肪酶，再加入短链醇，20℃～45℃，反应1h～10h，即得；其中，所述固定化脂肪酶的重量为油相重量的0.5％～8％，所述短链醇与油相的摩尔比为(0.2～3)：1。
11.在其中一些实施例中，步骤(1)中所述液体脂肪酶为液体脂肪酶mas1，所述液体脂肪酶的重量为原料油重量的0.8％～3％。
12.在其中一些实施例中，步骤(3)中所述固定化脂肪酶为固定化脂肪酶mas1，所述固
定化脂肪酶mas1的重量为油相重量的1％～2％。
13.在其中一些实施例中，步骤(1)中所述短链醇与原料油的摩尔比为0.7～2：1。
14.在其中一些实施例中，步骤(3)中所述短链醇与油相的摩尔为0.5～2：1。
15.在其中一些实施例中，步骤(1)中所述反应温度为30℃～45℃，反应时间为12h～18h；和/或步骤(3)中所述反应温度为30℃～45℃，反应时间为4h～8h。
16.在其中一些实施例中，步骤(1)和步骤(3)中所述短链醇为甲醇或乙醇。
17.在其中一些实施例中，步骤(2)中通过静置分层或离心分离油相和水相。
18.在其中一些实施例中，所述液体化脂肪酶或固定化脂肪酶来源于根霉、曲霉、假丝酵母、青霉、毛霉、须霉或假单胞菌；所述固定化脂肪酶采用吸附法、共价法、包埋法或交联法进行固定化。
19.在其中一些实施例中，步骤(1)中所述原料油为食用废弃油、潲水油、脱臭馏出物、藻油、酸化油或食用动植物油。
20.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
21.在本发明中，采用液体脂肪酶和固定化脂肪酶两步酶法来制备生物柴油，其首先控制液体脂肪酶催化反应中的加酶量、甲醇加量和反应时间，从而可以控制原料油的脂肪酸甲酯转化率在一定范围(将底物反应到一定程度，再进行固定化酶的催化，可以减少固定化脂肪酶的用量，在一定程度上能够降低固定化脂肪酶的成本)；然后再通过固定化脂肪酶进行进一步的催化反应，制备得到的生物柴油中脂肪酸甲酯含量可达到95％以上，酸价可降至0.5mg/g～1mg/g；且固定化脂肪酶重复使用的次数可以增加到30次后，活力才开始下降(直接用固定化脂肪酶催化反应，重复使用次数18次，活力就显著下降了)，弥补了固定化脂肪酶价格昂贵的缺点，具有很好的经济效益。
附图说明
22.图1为本发明实施例5中制备的生物柴油的脂肪酸甲酯含量结果。
23.图2为本发明实施例5中制备的生物柴油的酸价图。
24.图3为本发明对比例1中采用液体脂肪酶催化制备生物柴油的反应结果。
25.图4为本发明对比例2中采用固定化脂肪酶催化制备生物柴油的脂肪酸甲酯含量结果。
26.图5为本发明对比例2中采用固定化脂肪酶催化制备生物柴油的酸价图。
27.图6为本发明试验例1中使用固定化脂肪酶催化不同脂肪酸甲酯含量的原料油反应过程中，油样中脂肪酸甲酯含量与反应时间的关系图。
28.图7为本发明试验例1中使用固定化脂肪酶催化不同脂肪酸甲酯含量的原料油反应后，所对应产物的酸价结果。
29.图8为本发明试验例2中固定化脂肪酶法和液体脂肪酶-固定化脂肪酶法催化制备生物柴油后，固定化脂肪酶的稳定性对比结果。
具体实施方式
30.为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本
发明公开内容的理解更加透彻全面。
31.除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。本发明所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
32.在本发明中，发明人经过大量的实验发现，与液体脂肪酶和固定化脂肪酶一步酶法制备生物柴油相比，将液体脂肪酶与固定化脂肪酶结合，两步酶法催化制备生物柴油，能够克服液体脂肪酶转化效率不高，固定化脂肪酶价格昂贵的缺陷，催化效率显著提高，且成本也显著下降，具有很好的经济效益。
33.本发明的酶法制备生物柴油的方法，具体包括以下步骤：
34.(1)、向反应器中加入原料油、液体脂肪酶、短链醇(甲醇或乙醇)，在液体脂肪酶的作用下，催化酯化反应和酯交换反应，当反应的脂肪酸甲酯转化率达到55％～92％时(优选为75％～85％)，停止反应，得到混合反应液；该步的液体脂肪酶，其催化效果不用达到95％以上，所需甲醇量小，反应时间短，甲醇所带来的毒害作用可以减小。所用的液体脂肪酶可为mas1或其他效果好的酶制剂。在该步骤中，反应体系中总水分含量(包含额外加的水和液体脂肪酶中所含水分)占原料油重量的0.5％～10％。
35.(2)、将混合反应液静置分层或离心后分离，分别得到油相、水相，回收油相用于后续的催化反应；分离有助于去除油料中的杂质，同时副产物甘油已经去除了一部分，因此，有助于提高固定化脂肪酶的稳定性。
36.(3)、将回收的油相与固定化脂肪酶混合，再加入短链醇(甲醇或乙醇)开始进一步的催化反应，反应结束后能将原料油转换为生物柴油。固定化脂肪酶催化反应的时间短，可以减少酶与甲醇的接触时间，从而也有助于提高固定化脂肪酶的重复利用性。
37.采用本发明的二步酶法制备生物柴油，其产物中脂肪酸甲酯含量可高于95％，酸价低于1mg/g，固定化脂肪酶可以稳定使用。
38.以下实施例中，生物柴油中脂肪酸甲酯含量的测定方法如下：
39.利用配备示差折光检测器、安装色谱柱phenomenex luna 5u silica 100a(250mm
×
4.60mm)的高效液相色谱仪测定脂肪酸甲酯的含量。具体的检测条件为：流动相为正己烷、异丙醇和甲酸按体积比为18:1:0.003配制的混合液，流速为1ml/min，进样量为10μl。取20mg待测样品溶于1ml流动相中，加入0.5g无水硫酸钠，震荡离心(10000rpm，3min)，吸取上清液，进行样品检测。
40.酸价的测定方法依照gb 5009.229-2016进行测定。
41.以下实施例中，所使用的脂肪酶来源为广东优酶生物制造有限公司、诺维信公司等。
42.以下结合附图和具体实施例来详细说明本发明。
43.实施例1两步酶法催化棕榈油制备生物柴油
44.以棕榈油为原料油，使用两步酶法催化原料油与甲醇反应制备生物柴油，包括以下步骤：
45.(1)、在反应器中加入100g原料油、2g液体脂肪酶mas1，再加入甲醇，30℃进行反应；所述甲醇与原料油的摩尔比为0.7：1；
46.(2)、反应18h，脂肪酸甲酯的含量达到75％，停止反应，将反应液离心，分离得到油相和水相；
47.(3)、将上述离心所得的油样称取85g加入新的反应器中，加入0.85g固定化脂肪酶mas1，再加入甲醇，30℃进行反应，反应6h反应达到平衡，停止反应，减压蒸馏回收甲醇和甘油，即得生物柴油；其中，甲醇与油的摩尔比为0.4：1。
48.该实施例中，两步酶法反应后，脂肪酸甲酯含量为95.82％，酸价为0.93mg/g。
49.实施例2两步酶法催化食用废弃油制备生物柴油
50.以食用废弃油为原料油，使用两步酶法催化原料油与甲醇反应制备生物柴油，包括以下步骤：
51.(1)、在反应器中加入100g原料油、3g液体脂肪酶mas1，再加入甲醇，30℃进行反应；所述甲醇与原料油的摩尔比为0.7：1；
52.(2)、反应12h，脂肪酸甲酯含量达到80％，停止反应，将反应液离心，分离得到油相和水相；
53.(3)、将步骤(2)所得的油称取90g加入新的反应器中，加入0.9g固定化脂肪酶mas1，再加入甲醇，30℃进行反应5h，达到平衡，停止反应，减压蒸馏回收甲醇和甘油，即得生物柴油；其中，甲醇与油的摩尔比为0.4：1。
54.该实施例中，两步酶法反应后，脂肪酸甲酯含量为96.12％，酸价为0.92mg/g。
55.实施例3两步酶法催化潲水油制备生物柴油
56.以潲水油为原料油，使用两步酶法催化原料油与甲醇反应制备生物柴油，包括以下步骤：
57.(1)、在反应器中加入100g原料油、0.8g液体脂肪酶mas1，再加入甲醇，30℃进行反应；所述甲醇与原料油的摩尔比为0.7：1；
58.(2)、反应15h，脂肪酸甲酯含量达到79％，停止反应，将反应液离心，分离得到油相和水相；
59.(3)、将步骤(2)所得的油称取91g加入新的反应器中，加入1.5g固定化脂肪酶mas1，再加入甲醇，30℃进行反应4h，达到平衡，停止反应，减压蒸馏回收甲醇和甘油，即得生物柴油；其中，每克油相中加入甲醇与油的摩尔比为0.4：1。
60.该实施例中，两步酶法反应后，脂肪酸甲酯含量为97.38％，酸价为0.86mg/g。
61.实施例4两步酶法催化微藻油脂制备生物柴油
62.以微藻油脂为原料油，使用两步酶法催化原料油与甲醇反应制备生物柴油，包括以下步骤：
63.(1)、在反应器中加入100g原料油、5g液体脂肪酶mas1，再加入甲醇，30℃进行反应；所述甲醇与原料油的摩尔比为0.7：1；
64.(2)、反应14h，脂肪酸甲酯含量达到90％，停止反应，将反应液离心，分离得到油相和水相；
65.(3)、将将步骤(2)所得的油称取90g加入新的反应器中，加入2g固定化脂肪酶mas1，再加入甲醇，30℃反应5h，达到平衡，停止反应，减压蒸馏回收甲醇和甘油，即得生物柴油；其中，甲醇与油的摩尔比为0.4：1。
66.该实施例中，两步酶法反应后，脂肪酸甲酯含量为96.37％，酸价为0.89mg/g。
67.实施例5两步酶法催化餐饮废油制备生物柴油
68.以餐饮废油为原料油，使用两步酶法催化原料油与甲醇反应制备生物柴油，包括以下步骤：
69.(1)、在反应器中加入100g原料油、3g液体脂肪酶mas1和甲醇，30℃反应；所述甲醇与原料油的摩尔比为0.8：1；
70.(2)、反应4h，脂肪酸甲酯含量为60.1％，停止反应，将反应液离心，分离得到油相和水相；
71.(3)、将步骤(2)中所得的油92g加入新的反应器中，在油相中加入2g固定化脂肪酶mas1和甲醇，甲醇与油的摩尔比为0.4：1，30℃，反应2h，减压蒸馏回收甲醇和甘油，即得生物柴油。
72.反应结果如图1～图2，从图1可知，反应达到平衡时，固定化脂肪酶可将餐饮废油转换为生物柴油，脂肪酸甲酯含量可达到96.35％；从图2可知，酸价为0.74mg/g。
73.对比例1液体脂肪酶催化餐饮废油制备生物柴油
74.以餐饮废油为原料油，使用液体脂肪酶mas1催化原料油与甲醇反应制备生物柴油，包括以下步骤：
75.(1)、在反应器中加入100g原料油、3g液体脂肪酶mas1和甲醇；所述甲醇与原料油的摩尔比为1.15：1；
76.(2)、30℃反应12h，减压蒸馏回收甲醇和甘油，即得生物柴油。
77.反应结果如图3，从图3可知，反应结束时液体脂肪酶可将餐饮废油转换为生物柴油，脂肪酸甲酯含量可达到92％，产物的酸价为3.58mg/g。
78.对比例2固定化脂肪酶催化餐饮废油制备生物柴油
79.以餐饮废油为原料油，使用固定化脂肪酶mas1催化原料油与甲醇反应制备生物柴油，包括以下步骤：
80.(1)、在反应器中加入100g原料油、2g固定化脂肪酶mas1和甲醇；所述甲醇与原料油的摩尔比为1.15：1；
81.(2)、30℃，反应6h达到平衡，减压蒸馏回收甲醇和甘油，即得生物柴油。
82.反应结果如图4～图5，从图4可知，固定化脂肪酶可高效的将餐饮废油转换为生物柴油，产物中脂肪酸甲酯含量可达到96％；从图5可知，产物的酸价为2.8mg/g。
83.试验例1对不同的脂肪酸甲酯含量的油料进行固定化脂肪酶催化反应，对制备的生物柴油的性能影响
84.以不同脂肪酸甲酯含量的油料为原料，采用固定化脂肪酶催化制备生物柴油，包括以下步骤：
85.(1)、在反应器中加入1000g原料油、30g固定化脂肪酶mas1，加入甲醇(甲醇与原料油的摩尔比为1.15：1)，30℃反应6h后停止反应，减压蒸馏回收甲醇和甘油，即得生物柴油；
86.(2)、将生物柴油与原料油进行调配，制得不同脂肪酸甲酯含量的油料各100g，其脂肪酸甲酯含量分别达到55％、65％、75％、85％、95％，将其转换为100％脂肪酸甲酯所需的理论甲醇含量分别为4.95、3.85、2.75、1.65、0.55g。
87.(3)、将上述调配的油料各100g加入不同的反应器中，加入2g固定化脂肪酶mas1；再分别加入甲醇，其甲醇加量均比完全转化为甲酯所需的理论甲醇含量高20％，即所对应
上述所调配不同比例的油，甲醇加量分别为5.94、4.62、3.3、1.98、0.66g，反应30℃，反应4h全部达到平衡并停止反应，减压蒸馏回收甲醇和甘油，即得生物柴油。
88.反应结果如图6～图7，从图6～7可知，使用固定化脂肪酶催化时，产物中脂肪酸甲酯均可达到95％；当原料中脂肪酸甲酯含量为75％，再开始固定化脂肪酶催化的反应，产物中酸价最低。
89.试验例2不同方法催化餐饮废油制备生物柴油后，固定化脂肪酶的稳定性
90.本试验例比较了一步酶法和二步酶法催化餐饮废油制备生物柴油后，固定化脂肪酶的稳定性。
91.1、一步固定化脂肪酶法
92.(1)、在反应器中加入100g原料油(餐饮废油)、4g固定化脂肪酶mas1和甲醇；所述甲醇与原料油的摩尔比为1.15：1；
93.(2)、30℃，反应6h后，过滤回收固定化脂肪酶，减压蒸馏回收甲醇和甘油，即得生物柴油。
94.(3)、将上述回收的固定化脂肪酶倒回原反应器，加入新的原料油，重复步骤(1)～(2)的实验。
95.二、固定化脂肪酶-液体脂肪酶法
96.(1)、在反应器中加入100g原料油(餐饮废油)、4g液体脂肪酶mas1，再分别加入甲醇(甲醇与原料油的摩尔比为0.7：1)，30℃进行反应；
97.(2)、反应5h，脂肪酸甲酯含量达到75％，停止反应，将反应液离心，分离得到油相和水相；
98.(3)、将收集的90g离心后的油加入新的反应器中，在油相中加入2g固定化脂肪酶mas1，再分别加入甲醇(甲醇与原料油的摩尔比为0.4：1)，30℃，反应3h，停止反应，过滤回收固定化脂肪酶，减压蒸馏回收甲醇和甘油，即得生物柴油。
99.(4)、将上述回收的固定化脂肪酶mas1倒回原反应器，重复步骤(3)实验。
100.一步固定化脂肪酶法和固定化脂肪酶-液体脂肪酶法所回收固定化脂肪酶连续使用后的酶活力及产物中脂肪酸甲酯含量的变化情况如图8所示。从图8可知，采用一步固定化脂肪酶法所回收固定化脂肪酶连续使用18个批次后，酶活力显著降低，第18批次反应6h后，产物中脂肪酸甲酯的含量仅为85％。而采用固定化脂肪酶-液体脂肪酶法所回收固定化脂肪酶连续使用30个批次，与初始酶活相比，酶活力无显著变化，脂肪酸甲酯的含量不低于90％。
101.本试验例的结果表明，采用本发明的二步酶法制备生物柴油，固定化脂肪酶的稳定性更高。
102.以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
103.以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。