醛缩酶催化合成3-羟基-3-甲基丁酸的方法与流程

本发明属于生物催化，具体地说，涉及一种醛缩酶催化合成3-羟基-3-甲基丁酸的方法。

背景技术：

1、3-羟基-3-甲基丁酸，又称β-羟基-β-甲基丁酸，简称hmb，是l-亮氨酸的代谢衍生物，通常作为膳食补充剂和某些医药食品的成分。3-羟基-3-甲基丁酸钙，cas：135236-72-5，是3-羟基-3-甲基丁酸的钙盐形式。该物质可以作为功能性饲料添加剂，促进动物生长，减少脂肪，提高瘦肉率，保证动物健康。在功能食品领域，可以作为运动保健品，在运动员训练中防止肌肉损伤，促进肌肉蛋白质的合成，抑制肌肉蛋白分解，维持运动员瘦体重，提高运动能力，维护细胞膜完整性，提高免疫功能和降低炎症反应。该物质主要运用于动物营养、运动营养及功能食品领域，推荐有效剂量为2-3g/d。

2、目前国内外生产hmb的方法主要有化学法、微生物前体发酵法和酶催化法。化学法主要包括氧化法和氧化羧基化法，是目前生产hmb钙盐的主要方法。氧化法以乙酸为初始底物，用硫酸、双氧水等氧化剂氧化得到过氧乙酸，然后与二丙酮醇混合氧化得到3-羟基-3-甲基丁酸甲酯，再经碱水解得到hmb。该方法主要问题是过氧乙酸是高危化合物。氧化羧基化法是以叔丁醇为初始底物，硫酸亚铁和双氧水为氧化剂，在硫酸溶液中通入一氧化碳气体制备hmb。该反应副产物含量高，反应条件苛刻，需要绝对无氧化境，产率很低。

3、随着环保理念越来越深入人们的生活和工业界，绿色环保的hmb制备途径已经成为研究热点，相对应的发酵法和生物合成法日益受到业内青睐。微生物前体发酵法是在微生物发酵过程中添加3-甲基丁酸为前体，经过四种酶代谢生成hmb。该方法发酵周期长，后期分离纯化困难，转化率也较低。酶催化法是以l-亮氨酸为初始底物，经两步酶催化得到hmb，该反应在l-亮氨酸初始浓度为60mm时，得到约0.75g/l hmb，底物转化率35％左右。该路线整体酶活较低，初始底物、产物浓度均较低，底物转化率低，且需要辅酶循环系统支持，只有文献报道，未见工业化生产实例。

4、发明人也研究开发了酶催化法和微生物发酵法，例如在专利cn109251940b中报道了对食品安全的解脂耶氏酵母基因改造，构建的工程菌能够以葡萄糖为碳源直接发酵生产β-羟基-β-甲基丁酸，产量最高可达10g/l，但仍然存在生产周期长、从发酵液中分离提纯hmb工序复杂导致经济成本较高的缺陷。相对而言，酶催化法生产周期短，后处理更容易，发明人还在专利cn108866017b中报道了使用细胞色素p450氧化酶催化β-甲基丁酸进行羟基化反应制备hmb。但中试规模和车间试生产中，由于β-甲基丁酸臭味很大，使得生产和后处理的车间环境充满了异味而引起操作环境不适。

技术实现思路

1、用廉价的大宗化工原料代替价格相对较贵的化工产品比如3-甲基丁酸作为酶催化底物是最为理想的生物催化方案。经过多年研究，发明人探索出一条新的酶催化合成3-羟基-3-甲基丁酸的途径，使用的底物是最基本的化工原料乙酸和丙酮。具体地，本发明包括如下技术方案。

2、一种醛缩酶催化合成3-羟基-3-甲基丁酸的方法，包括如下步骤：以乙酸和丙酮为底物，使用氨基酸序列为seq id no:1的来源于酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)的醛缩酶或者与seq id no:1有90％以上、优选95％以上、优选96％以上、优选97％以上、优选98％以上、更优选99％以上同源性、且酶活力相比seq id no:1提高的醛缩酶突变体进行催化，得到目标产物3-羟基-3-甲基丁酸。

3、mgveqilkrktgvivgedvhnlftyakehkfaipainvtssstavaaleaardskspiilqtsnggaayfagkgisnegqnasikgaiaaahyirsiapaygipvvlhsdhcakkllpwfdgmleadeayfkehgeplfsshmldlseetdeenistcvkyfkrmaamdqwlemeigitggeedgvnnenadkedlytkpeqvynvykalhpispnfsiaaafgnchglyagdialrpeilaehqkytreqvgckeekplflvfhggsgstvqefhtgidngvvkvnldtdcqyayltgirdyvlnkkdyimspvgnpegpekpnkkffdprvwvregektmgakitksletfrttntl(seq id no:1)。

4、优选地，上醛缩酶突变体的氨基酸序列为seq id no:3。其为seq id no:1第45位v替换为i、第81位n替换为k、第99位p替换为q、第102位g替换为s、第143位m替换为t的突变体：

5、

6、

7、上述反应体系中，上述醛缩酶seq id no:1或者所述突变体例如seq id no:3可以为纯酶或者粗酶，可以为游离酶或者固定化酶。

8、在一种可替代的实施方式中，在反应体系中，所述醛缩酶seq id no:1或者所述突变体例如seq id no:3还可以呈其表达微生物菌体细胞形式。

9、上述反应体系的ph值可以为6.5-8.5、优选ph 6.9-8.2、优选ph 7.1-8.0、优选ph7.2-7.8、优选ph 7.3-7.6，例如ph 7.5左右。

10、上述反应体系的反应温度为15-45℃、优选20-42℃、优选22-40℃、优选25-38℃，例如35℃左右。

11、优选地，所述3-羟基-3-甲基丁酸呈钙盐形式，即3-羟基-3-甲基丁酸钙。

12、本发明的第二个方面提供了一种醛缩酶突变体，其氨基酸序列为seq id no:3。

13、本发明还提供了编码上述醛缩酶突变体seq id no:3的基因。

14、在一种实施方式中，编码上述醛缩酶突变体seq id no:3的基因可以为核苷酸序列seq id no:4所示的多核苷酸、或者与seq id no:4有90％以上、优选92％以上、优选95％以上、优选97％以上、优选98％以上、更优选99％以上同源性的多核苷酸。

15、本发明还提供了包含上述基因的质粒。

16、例如，上述质粒可以是psh质粒或者pet载体例如pet22b、pet24a、pet28a。

17、本发明还提供了表达上述醛缩酶突变体的微生物，例如是基因组中整合了编码上述醛缩酶突变体seq id no:3的基因例如seq id no:4，或者是转化了上述质粒的工程菌。

18、当上述醛缩酶seq id no:1或者其突变体例如seq id no:3呈微生物菌体形式时，所述微生物优选是增殖速度快、适合于表达外源重组蛋白的微生物，例如选自枯草芽孢杆菌、短乳杆菌、大肠杆菌、木兰假丝酵母、毕赤酵母、酿酒酵母。优选微生物是大肠杆菌，更优选是大肠杆菌bl21(de3)。

19、当醛缩酶seq id no:1通过大肠杆菌表达时，其编码基因的核苷酸序列可以为seqid no:2。

20、优选地，步骤a的反应体系为缓冲液体系，优选磷酸盐缓冲液，其ph值为6.5-8.5、优选ph 6.9-8.2、优选ph 7.1-8.0、优选ph 7.2-7.8、优选ph 7.3-7.6，例如ph 7.5左右。

21、上述反应温度为15-40℃、优选20-38℃、优选22-35℃、优选25-30℃。

22、本发明筛选出的醛缩酶seq id no:1，能够以大宗化工原料乙酸和丙酮为底物合成出3-羟基-3-甲基丁酸，从而开拓出一条具有经济意义的hmb合成途径，应用前景广阔。另外，本发明进一步利用体外定向进化等分子生物学手段建立突变库，通过高通量筛选获得酶活较高的菌株，该菌株表达醛缩酶突变体seq id no:3，菌株酶活比初始酶活提高了125倍，在实验室小体系的转化中，产物hmb含量达到190g/l，底物转化率达到95％。