一种基于DNA步行器和超支化滚环扩增的甲基转移酶传感器及其应用

一种基于dna步行器和超支化滚环扩增的甲基转移酶传感器及其应用
技术领域
1.本发明涉及生物传感器领域，特别是涉及一种基于dna步行器和超支化滚环扩增的甲基转移酶传感器及其应用。


背景技术：

2.dna甲基化涉及甲基基团从s-腺苷-l-甲硫氨酸(sam)转移到胞嘧啶的c-5位或腺嘌呤的n6位，在真核生物和原核生物的基因组印迹、基因表达和细胞发育中发挥重要作用。dna甲基化修饰作为调控基因表达的一种重要方式，由dna甲基转移酶催化完成，在细菌的生长形态以及生理代谢等方面都发挥着重要的作用，从而增加细菌在多变环境中的生存力。因此，开发一种灵敏、准确的dna甲基转移酶活性检测方法对细菌生长形态和耐药性的研究是非常必要的。
3.迄今为止，已经开发了多种方法用于dna甲基转移酶测定，如高效液相色谱、质谱、微阵列、比色检测、荧光检测、电化学检测、电化学发光法和放射性[3h]标记的s-腺苷-甲硫氨酸测定。其中，荧光检测法具有成本低、操作相对简单、响应速度快、重复性和一致性好等优点，在dna甲基转移酶检测中具有较高的应用价值。然而，这些荧光传感器的灵敏度不足，准确的dna甲基转移酶活性测定可能需要建立更灵敏的扩增策略。因此，在甲基转移酶测定中应用了许多信号放大策略，以实现更高的检测灵敏度，包括实时荧光定量pcr、杂交链式反应(hcr)、催化发夹组装(cha)和滚环扩增(rca)。在这些扩增策略中，实时荧光定量pcr因其高可用性和通用性而被认为是最成功的一种。然而，pcr需要复杂的热循环步骤、复杂的设备和较长的操作时间。与pcr相比，hcr和cha是代表性的等温非酶dna扩增，其操作过程快捷方便。但由于多个发夹结构倾向于彼此杂交，所以hcr和cha的生物传感器会受到高背景信号的影响，rca作为新一代dna等温扩增技术，由于其高效、简便，已被用于构建生物传感器。然而，rca的扩增效率受到限制，基于rca的传感器的灵敏度低于pcr。为了提高rca的灵敏度，可以通过引入与rca产物互补的第二个引物将线性rca(lrca)转化为超支化滚圈扩增(hrca)，该引物具有比lrca高得多的扩增效率(高达109倍)。该方法已成功应用于构建多种不同目标的生物传感器。例如，福州大学林振宇的团队通过甲基化敏感裂解引物和hrca开发了一种无标记的dam甲基转移酶生物传感器(检测极限＝1.8u/ml)。该传感器的检出限较高，灵敏度与无酶传感器传感器相比有较大差距。
[0004]
dna步行器是一种新型的分子机器，它可以沿着预先定义的dna轨迹行走。它已广泛应用于生物传感器、药物输送和生物计算。dna步行器可以在短时间内完成底物的快速释放，从而实现高效的显著信号增强。


技术实现要素：

[0005]
本发明的目的是提供一种基于dna步行器和超支化滚环扩增的甲基转移酶传感器及其应用，以解决上述现有技术存在的问题，本发明通过使用dna步行器-hrca策略，实现了
甲基转移酶的高灵敏度检测。
[0006]
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
[0007]
本发明提供一种基于dna步行器和超支化滚环扩增的甲基转移酶传感器，所述甲基转移酶传感器包括识别探针、dna步行器和超支化滚环扩增体系；所述识别探针包括hm识别探针和/或hd识别探针，所述hm识别探针的核苷酸序列如seq id no.1所示，所述hd识别探针的核苷酸序列如seq id no.2所示。
[0008]
进一步地，所述超支化滚环扩增体系包括phi29dna聚合酶、引物1、引物2和dntp；所述引物1的核苷酸序列如seq id no.9所示，所述引物2的核苷酸序列如seq id no.10所示。
[0009]
本发明还提供上述的甲基转移酶传感器在制备检测甲基转移酶的试剂盒中的应用。
[0010]
本发明还提供一种检测甲基转移酶的试剂盒，包含上述的甲基转移酶传感器。
[0011]
进一步地，所述试剂盒还包括padlock探针，所述padlock探针的核苷酸序列如seq id no.8所示。
[0012]
进一步地，所述试剂盒还包括功能化磁珠，所述功能化磁珠的制备方法包括：将生物素修饰的dnazyme和阻断剂在tris-hcl缓冲液中混合，反应后形成dnazyme阻断剂双链，随后，将链霉亲和素磁珠分散在tris-hcl缓冲液，之后加入所述dnazyme阻断剂双链，反应后得到所述功能化磁珠；
[0013]
所述dnazyme的核苷酸序列如seq id no.4所示；所述阻断剂的核苷酸序列如seq id no.5所示。
[0014]
本发明还提供上述的甲基转移酶传感器或试剂盒在甲基转移酶检测中的应用。
[0015]
本发明还提供一种检测甲基转移酶的方法，包括利用上述的甲基转移酶传感器或试剂盒进行甲基转移酶检测的步骤。
[0016]
进一步地，当所述甲基转移酶为m.sssi甲基转移酶时，所述方法包括：使用上述的甲基转移酶传感器中的hm识别探针，通过m.sssi甲基转移酶和hpaii核酸内切酶的相互作用，引发dna步行器和超支化滚环扩增反应，通过定量荧光信号强度实现对m.sssi甲基转移酶的含量检测。
[0017]
进一步地，当所述甲基转移酶为dam甲基转移酶时，所述方法包括：使用上述的甲基转移酶传感器中的hd识别探针，通过dam甲基转移酶和dpni核酸内切酶的相互作用，引发dna步行器和超支化滚环扩增反应，通过定量荧光信号强度实现对dam甲基转移酶的含量检测。
[0018]
本发明公开了以下技术效果：
[0019]
本发明创新性地将dna步行器引入hrca传感系统，以构建新型m.sssi甲基转移酶生物传感器。该生物传感器可以集成dna步行器和hrca，从而避免使用多个发夹自组装并导致低背景信号。在没有m.sssi甲基转移酶的情况下，发夹hm被hpaii核酸内切酶切割，从而产生称为t-dna的dna片段。t-dna可以触发链置换反应，释放pb
2+
依赖的dna酶。随后，dna步行器通过切割基底逐渐在磁珠表面行走，从而产生大量ssdna探针(c-dna)。然后，释放的c-dna触发了随后的hrca反应，产生了大量不同长度的dsdna。sybr green i被嵌入dsdna的凹槽中，产生显著的荧光信号。在m.sssi甲基转移酶的存在下，发夹hm被甲基化，无法被核酸
内切酶切割。随后的dna步行器-hrca反应未启动，荧光信号保持在低水平。由于dna步行器和hrca的双重扩增策略，本发明生物传感器的灵敏度较高，检测限可达0.0002u/ml。由于m.sssi甲基转移酶对发夹hm位点的特异性识别，该生物传感器也具有优异的选择性。此外，本发明提出的生物传感器可用于检测另一种甲基转移酶(dam甲基转移酶)。本发明的结果表明，dna步行器-hrca策略在dna甲基化相关检测中具有巨大的应用潜力。
[0020]
本发明的基于dna步行器和超支化滚环扩增的生物传感器的优点在于：(1)灵敏度高，结合了两层扩增反应对比现有技术极大地提高了检测的灵敏度。(2)背景信号低，本发明避免了等温扩增中常用的多个发夹结构自组装的策略，降低了检测的空白信号。(3)可以通过简单的识别探针设计实现对两种不同的甲基转移酶实现同时检测。(4)实验不需要复杂的温度循环和昂贵的仪器，仅仅在一个离心管中就可以完成，系统成本不高。
附图说明
[0021]
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0022]
图1为基于dna步行器和hrca扩增的m.sssi甲基转移酶传感器的传感策略；其中，a为当体系中不存在m.sssi甲基转移酶时，b为当体系中存在m.sssi甲基转移酶时；
[0023]
图2为dna步行器-hrca体系对m.sssi甲基转移酶的测定；其中，a为dna步行器-hrca反应的m.sssi甲基转移酶传感器的荧光光谱，对应于不同浓度的m.sssi甲基转移酶；b为不同浓度的m.sssi甲基转移酶(范围＝0-1u/ml)在530nm处的荧光强度；c为不同浓度的m.sssi甲基转移酶(范围＝0.0002-0.1u/ml)在530nm处的荧光强度变化值对甲基转移酶浓度对数的校准曲线；
[0024]
图3为基于dna步行器和hrca扩增的dam甲基转移酶传感器的传感策略；其中，a为当体系中不存在dam甲基转移酶时；b为当体系中存在dam甲基转移酶时；
[0025]
图4为dna步行器-hrca体系对dam甲基转移酶的测定；其中，a为dna步行器-hrca反应的dam甲基转移酶传感器的荧光光谱，对应于不同浓度的dam甲基转移酶；b为不同浓度的dam甲基转移酶(范围＝0-1u/ml)在530nm处的荧光强度；b中插图为不同浓度的dam甲基转移酶(范围＝0.001-0.2u/ml)在530nm处的荧光强度变化值对甲基转移酶浓度对数的校准曲线。
具体实施方式
[0026]
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
[0027]
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
[0028]
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
[0029]
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
[0030]
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
[0031]
以下实施例中用到的dna序列如表1所示：
[0032]
表1
[0033][0034]
以下实施例用到的功能化磁珠的制备方法如下：
[0035]
将生物素修饰的dnazyme(1μm)和阻断剂(1μm，即表1中的blocker)在tris-hcl缓冲液(25mm tris-hcl，200mm naac，ph 7)中的混合溶液在90℃下加热10分钟，然后冷却至25℃以形成dnazyme阻断剂双链。随后，将10μl链霉亲和素磁珠(smb1mg/ml)用tris-hcl缓冲液漂洗3次，并分散在tris-hcl缓冲液中。将dnazyme阻断剂双链和生物素修饰的底物(即
表1中的substrate)以1比20的摩尔比例混合并添加到链霉亲和素磁珠中，然后在室温下振荡1小时，得到功能化磁珠，储存在4℃下用于后续实验。磁性分离后分散功能化磁珠以去除多余的dna链。
[0036]
以下实施例中，dna步行器为：如图1所示，在功能化磁珠上修饰pb
2+
依赖性dnazyme，其被阻断剂(blocker序列)抑制。在t-dna存在下，通过与t-dna杂交去除阻断剂，导致pb
2+
依赖性dnazyme的释放。添加pb
2+
后的dnazyme被激活并和底物(substrate)杂交。结果，substrate被切割，导致输出dna(c-dna)的释放。带有pb
2+
依赖性dnazyme的悬挂链与另一个底物dna(substrate)杂交，并引发下一次切割。因此，dnazyme在磁珠表面的自主行走伴随着杂交、切割和释放循环，从而产生大量的c-dna链。因此，一条t-dna链可以诱导底物dna的裂解和各种c-dna链的释放，完成dna步行器的构筑和信号的放大。通过磁分离去除磁珠，并将反应产物(c-dna)与锁环探针杂交用于hrca反应。
[0037]
实施例1dna步行器-hrca体系的构建及m.sssi甲基转移酶的测定
[0038]
dna步行器-hrca体系m.sssi甲基转移酶传感器的构建：hm为识别探针，通过m.sssi甲基转移酶和hpaii核酸内切酶的相互作用，引发后续的dna步行器和超支化滚环扩增反应，通过定量荧光信号强度实现对m.sssi甲基转移酶的超灵敏检测，检测原理见图1。
[0039]
m.sssi甲基转移酶的测定：
[0040]
首先，将2μl hm(2μm)与5μl sam(1600μm)和不同浓度的m.sssi甲基转移酶在37℃下孵育2小时。甲基化过程在50μl nebuffer 2(由new england biolabs提供)中进行。随后，将5μl cutsmart缓冲液(10
×
)和hpaii(20u/ml)在37℃下加入溶液中2h。将m.sssi/hpaii处理的产物加入到功能化磁珠溶液中，以在25℃下启动pb
2+-dnazyme辅助dna行走过程0.5h。随后，使用5μl(1mm)pb
2+
激活dna行走1h。最后，通过磁分离分离反应产物以获得不同浓度的输出dna(c-dna)，用于hrca反应。将获得的c-dna溶液与10nm padlock探针、800u t4 dna连接酶和10μl t4 dna连接酶缓冲液10
×
(由new england biolabs提供)混合。反应溶液的总体积为100μl。连接反应在20℃下进行1小时。然后，通过添加exo i(20u)和exo iii(20u)去除未反应的探针。将混合物加热至80℃，维持20分钟以使核酸外切酶失活。将连接反应产物添加到含有phi29 dna聚合酶缓冲液(由new england biolabs提供)、40nmprime 1和prime 2、0.5mm dntp和20u phi29 dnapcr的hrca反应混合物中。hrca反应在30℃下进行4小时，并加热至65℃，维持10分钟以终止聚合反应。然后，将4μl sybr green i添加到hrca产物中，并在荧光测量前孵育15分钟。使用日立f-4700荧光光谱仪进行m.sssi甲基转移酶的荧光检测。检测结果如图2所示，随着m.sssi甲基转移酶含量的增加，荧光强度逐渐降低，这是因为hm探针逐渐被甲基化，导致后续的内切酶和扩增实验无法进行。本发明可以用荧光强度定量m.sssi甲基转移酶的浓度。
[0041]
本实施例精确设计了发夹hm，其茎部序列为5'-ccgg-3'，可被hpaii核酸内切酶和m.sssi甲基转移酶识别。此外，t-dna被设计并入发夹hm的环部分。在没有m.sssi甲基转移酶的情况下，hpaii核酸内切酶可以识别和切割发夹hm。因此，发夹hm被分为两部分，一部分是t-dna，另一部分是双链dna。t-dna可以激活dna步行器和hrca放大器。而dna步行器和hrca级联的放大器由第一层dna步行器和第二层hrca组成。在存在t-dna的情况下，通过与t-dna杂交去除阻断dna，导致pb
2+
依赖性dnazyme的释放。与底物杂交的游离dnazyme在加入pb
2+
后被活化。结果，底物dna被切割，触发输出dna(c-dna)的释放。带有pb
2+
依赖性dna酶的
悬挂链与另一个底物dna杂交并触发下一个切割。因此，dnazyme在磁珠表面的自主行走伴随着杂交、切割和释放循环，从而产生大量的c-dna链，从而完成第一层信号放大。磁珠通过磁分离去除，反应产物(c-dna)与锁环探针杂交用于hrca反应。使用t4 dna连接酶完成环化反应，并生成圆形锁环探针。加入exo i和iii后，未反应的dsdna和ssdna被核酸外切酶消化，将圆形锁环探针单独留在溶液中。hrca反应在添加引物1和2、phi29 dna聚合酶和dntp后开始。引物2与部分圆形锁环探针互补，并在phi29 dna聚合酶和dntps的帮助下在3'端延伸，生成长单链dna。然后，长单链dna作为引物1杂交的模板。引物1被phi29 dna聚合酶延伸以取代下游生长的dna链，这为引物2的再次杂交提供了多个结合位点。因此，形成了大量不同长度的双链dna和单链dna。荧光信号指示剂sybr green i以极高的亲和力插入双链dna的凹槽中，产生强荧光信号。而当m.sssi甲基转移酶存在时，hm的茎环部分被甲基化，不能被hpaii核酸内切酶切割。由于pb
2+
依赖的dnazyme被阻断探针所阻断，阻止了随后的hrca扩增，因此dna步行器和hrca级联的放大器无法启动，荧光信号维持一个很低的状态。这样，本发明可以通过检测荧光信号来定量m.sssi甲基转移酶的浓度。
[0042]
实施例2dna步行器-hrca体系的构建及dam甲基转移酶的测定
[0043]
dna步行器-hrca体系dam甲基转移酶传感器的构建：以hd为识别探针，通过dam甲基转移酶和dpni核酸内切酶的相互作用，引发后续的dna步行器和超支化滚环扩增(hrca)反应，通过定量荧光信号强度实现对dam甲基转移酶的超灵敏检测。
[0044]
dam甲基转移酶的测定：
[0045]
2μl hd(2μm)与5μl sam(1600μm)、40u/mldpni、5μl cutsmart缓冲液(10
×
)和不同浓度的dam甲基转移酶在37℃下孵育2小时。甲基化过程在50μldam甲基转移酶反应缓冲液(由new england biolabs提供)中进行。随后将dam/dpni处理过的溶液加入到功能化磁珠溶液中，以启动与m.sssi mtase测定类似的dna步行器-hrca反应。将dam/dpni处理的产物加入到功能化磁珠溶液中，以在25℃下启动pb
2+-dnazyme辅助dna行走过程0.5h。随后，使用5μl(1mm)pb
2+
激活dna行走1h。最后，通过磁分离分离反应产物以获得不同浓度的输出dna(c-dna)，用于hrca反应。将获得的c-dna溶液与10nm padlock探针、800u t4 dna连接酶、10μlt4 dna连接酶缓冲液10
×
(由new england biolabs提供)混合。反应溶液的总体积为100μl。连接反应在20℃下进行1小时。然后，通过添加exo i(20u)和exo iii(20u)去除未反应的探针。将混合物加热至80℃，维持20分钟以使核酸外切酶失活。将连接反应产物添加到含有phi29 dna聚合酶缓冲液(由new englandbiolabs提供)、40nm引物1和引物2、0.5mm dntp和20uphi29 dnapcr的hrca反应混合物中。hrca反应在30℃下进行4小时，并加热至65℃，维持10分钟以终止聚合反应。然后，将4μl sybr green i添加到hrca产物中，并在荧光测量前孵育15分钟。使用日立f-4700荧光光谱仪进行dam甲基转移酶的荧光检测。检测结果如图4所示，随着dam甲基转移酶含量的增加，荧光强度逐渐增强，这是因为hd探针逐渐被甲基化，使得dpni核酸内切酶可以切割hd探针，引发后续的dna步行器和hrca扩增反应。这样，本发明可以用荧光强度定量dam甲基转移酶的浓度。
[0046]
通过设计识别发夹探针hd，实现对另一种甲基转移酶dam的检测。与m.sssi甲基转移酶/hpaii系统相反，dpni只能在dam甲基转移酶的辅助下切割甲基化识别序列(5'-g-ma-t-c-3')，从而触发随后的dna步行器hrca反应(见图3)。在没有dam甲基转移酶的情况下，dpni不能消化发夹hd，dna步行器-hrca反应被禁止，荧光信号较弱。在存在dam甲基转移酶
和dpni的情况下，荧光信号表现出显著增强。因此，本发明可以通过检测荧光信号来同时检测多种甲基转移酶的浓度。
[0047]
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。