一种利用铜绿假单胞菌发酵产生鼠李糖酯的发酵工艺的制作方法

1.本发明属于微生物技术领域，具体而言，涉及一种利用铜绿假单胞菌发酵产生鼠李糖酯的发酵工艺。


背景技术：

2.鼠李糖脂是一种阴离子表面活性剂，它们不仅溶于甲醇、氯仿和乙醚，在碱性水溶液中也表现出良好的溶解特性。然而鼠李糖脂最突出的特性是它的表面活性，如能显著降低水的表面张力，改变固体表面的润湿性，具有乳化、破乳、消泡、洗涤、分散与絮凝、抗静电和润滑等多种功能；
3.目前它比较广泛的应用于石油工业、绿色农业和生态环境方面，此外在食品行业、化妆品、医疗方面也有较大的应用潜力。其主要应用包括以下几个方面：
4.(1)石油领域的应用：鼠李糖脂作为一种生物表面活性剂，具有降低油水界面张力的作用，运用于初次采油和二次采油之后的三采技术。(2)农业领域应用：已有大量研究及实际应用证实,鼠李糖脂可以用在农作物、蔬菜、水果、花卉上用于刺激生长、辅助吸收营养、增加农药及肥料作用效果等，并经证实对人及动物无毒副作用。(3)环境领域应用：鼠李糖脂可用于处理多环芳烃pahs(如:应用于墨西哥湾漏油事故中释放出来的多环芳香族碳氢化合物)，用于处理水体中难生物降解cod，处理重金属污染等。(4)食品领域的应用：目前鼠李糖脂在食品方面多用作增大烘焙体积的膨大剂和调味剂，其食用安全性已通过了美国环保署(epa)的食用安全认证。(5)日化领域的应用：鼠李糖脂除了具备良好的表面活性外，还具备良好的细胞通透性，其来源于生物，具有良好的无毒害可降解特性。这些特点使其可广泛应用于各种日化产品中。(6)医药领域的应用：鼠李糖脂可用于处理皮肤灼伤及部分皮肤病，还可作为一种基础药物，相关研究及临床依据来源于克罗地亚和美国。
5.目前由于发酵技术的限制，在国内外的生产还不能进行工业化发酵的生产，急需提高发酵产量，才能达到工业化生产。


技术实现要素：

6.针对上述问题，本发明提供了一种利用铜绿假单胞菌发酵产生鼠李糖酯的发酵工艺。本发明所述的发酵工艺是通过在发酵前期ph上升的过程中，用磷酸将ph控制在7.80-7.85；等ph下降后，用氢氧化钠控制ph在7.10-7.15，能够维持酶的活力，从而达到提高鼠李糖酯发酵产量的目的。
7.本发明的目的及解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。
8.本发明的一个方面提供了一种利用铜绿假单胞菌发酵产生鼠李糖酯的发酵工艺，所述发酵工艺包括以下步骤：
9.s1：将产鼠李糖酯菌涂布到lb平板培养基上进行培养，得到lb平板菌；
10.s2：将上述lb平板菌挑取单菌落到lb摇瓶种子培养基上进行培养，得到lb摇瓶种子菌；
11.s3：将上述lb摇瓶种子菌转接到摇瓶种子培养基上进行再次扩大培养；
12.s4：将得到的种子再转接到发酵培养基中进行培养得到终产物；
13.在发酵培养进行时，在周期6小时开始用磷酸控制其ph在7.80-7.85，经过4-5h后，ph开始下降，采用氢氧化钠溶液进行控制其ph7.10-7.15；
14.在周期15h开始补油，按照每小时补入0.08-0.09％，周期65h，停止补油，在周期68-72h时放罐。
15.进一步地，步骤s1中所述产鼠李糖酯菌为铜绿假单胞菌pseudomonas aeruginosa pao1。
16.进一步地，步骤s2中所述lb摇瓶种子培养基配制方法如下：配方为：蛋白胨1％，酵母抽提粉0.5％，氯化钠0.5％，ph为自然ph，配制500ml体积，500ml摇瓶，每瓶分装100ml，消毒在121-122℃，0.10-0.11mpa，20-22min。
17.进一步地，步骤s1中所述培养条件为：温度35-37℃，时间20-24h。
18.进一步地，步骤s2中所述培养条件为：温度35-37℃，时间20-24h。
19.进一步地，步骤s3中所述摇瓶种子培养基配制方法如下：配方为：硝酸钠0.8-1.0％，氯化钾0.1-0.11％，氢氧化钠0.52-0.60％，糖蜜0.2-0.3％，磷酸0.982-1.1％，七水硫酸镁0.1-0.11％，葡萄糖0.4-0.5％，豆油4-5％；ph为自然ph；接种量为2-5％，32-37℃，21-23h。
20.进一步地，步骤s3中所述培养条件为：温度35-37℃，转速220rpm，时间20-24h。
21.进一步地，步骤s4中所述发酵培养基配制方法如下：配方为：硝酸钠0.8-1.0％，氯化钾0.1-0.11％，氢氧化钠0.52-0.60％，糖蜜0.2-0.3％，磷酸0.982-1.1％，七水硫酸镁0.1-0.11％，基础葡萄糖0.2-0.3％，基础豆油4-8％；ph为自然ph；灭菌条件121-122度，0.10-0.11mpa，20-22min。
22.进一步地，步骤s4中所述培养条件为：温度32-35℃，转速220rpm，时间20-24h。
23.进一步地，步骤s4中所述发酵过程为：种子的接种量10-20％，温度32-35℃，转速225rpm，流量1vvm，溶氧控制在30-35％；
24.在周期15h时开始补油，按照每小时补入0.08-0.09％，周期65h，停止补油，在周期68-72h时放罐，一共补入4-5％豆油。
25.借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点：
26.a：本发明的发酵工艺在发酵过程中通过控制ph，菌体活力得到提高，发酵产物提高，有之前的4％，提高到5-6％。
27.b：本发明的工艺发酵得到的鼠李糖脂最突出的特性是它的表面活性，如能显著降低水的表面张力，改变固体表面的润湿性，具有乳化、破乳、消泡、洗涤、分散与絮凝、抗静电和润滑等多种功能；完全可以应用于石油工业、绿色农业和生态环境等方面。
28.上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例详细说明如后。
附图说明
29.图1是本发明实施例1与对比实施例1的鼠李糖脂的产量对比图。
具体实施方式
30.为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面将结合本发明实施例及附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
31.实施例1
32.本实施例中所使用的产鼠李糖酯菌为铜绿假单胞菌pseudomonas aeruginosa pao1。
33.配制lb平板培养基50ml：蛋白胨1％，酵母抽提粉0.5％，氯化钠0.5％，琼脂粉1.5％，121℃高温灭菌20min，制成两个平板；
34.配制lb摇瓶种子培养基：蛋白胨1％，酵母抽提粉0.5％，氯化钠0.5％，ph为自然ph，配制100ml体积，500ml摇瓶，每瓶分装100ml，消毒在121℃，0.11mpa，20min。
35.配制摇瓶种子培养基2000ml：硝酸钠0.8％，氯化钾0.1％，氢氧化钠0.52％，糖蜜0.2％，磷酸0.982％，七水硫酸镁0.1％，葡萄糖0.4％，豆油5％；ph为自然ph；分装到10个500ml摇瓶中，每瓶装量200ml；消毒在121℃，0.11mpa，20min。
36.配制发酵培养基配方80l：硝酸钠0.8％，氯化钾0.1％，氢氧化钠0.52％，糖蜜0.2％，磷酸0.982％，七水硫酸镁0.1％，基础葡萄糖0.2％，基础豆油8％；ph为自然ph；灭菌条件121℃，0.11mpa，20min。
37.本实施例中进行100升发酵罐的放大，装量约为80升，以及一个灭过菌的无菌的储罐100ml进行收集鼠李糖脂发酵液泡沫，循环打入发酵罐中，具体操作如下：
38.1、取-80℃保存的甘油菌，按50ul菌液接种到lb平板培养基进行涂布，放在35℃培养箱中培养22小时；
39.2、将上述培养好的lb平板菌，挑取一个单菌落菌到lb摇瓶种子培养基中进行培养，培养条件为：37℃，220rpm，20h，得到lb摇瓶种子菌；
40.3、将上述lb摇瓶种子菌按照接种量为每瓶10ml转接到摇瓶种子培养基上进行在此扩大培养，培养条件为32℃，22h；
41.4、将得到的种子再转接到发酵培养基中进行培养得到终产物；在发酵培养进行时，起始搅拌在周期6小时开始用磷酸控制其ph在7.85，再经过5h后，ph开始下降，采用氢氧化钠溶液进行控制其ph7.15；从发酵周期10h开始补豆油，按照每小时补入0.064升的速率，补到周期60h，然后停止补油，一共补入3.2升豆油，周期70h放罐。
42.由本次实施例1得到的鼠李糖脂发酵液中含有鼠李糖脂的浓度为55g/l。
43.对比实施例1
44.配制lb平板培养基50ml：蛋白胨1％，酵母抽提粉0.5％，氯化钠0.5％，琼脂粉1.5％，121℃高温灭菌20min，制成两个平板；
45.配制lb摇瓶种子培养基：蛋白胨1％，酵母抽提粉0.5％，氯化钠0.5％，ph为自然ph，配制100ml体积，500ml摇瓶，每瓶分装100ml，消毒在121℃，0.11mpa，20min。
46.配制摇瓶种子培养基2000ml：硝酸钠0.8％，氯化钾0.1％，氢氧化钠0.52％，糖蜜0.2％，磷酸0.982％，七水硫酸镁0.1％，葡萄糖0.4％，豆油5％；ph为自然ph；分装到10个
500ml摇瓶中，每瓶装量200ml；消毒在121℃，0.11mpa，20min。
47.配制发酵培养基配方80l：硝酸钠0.8％，氯化钾0.1％，氢氧化钠0.52％，糖蜜0.2％，磷酸0.982％，七水硫酸镁0.1％，基础葡萄糖0.2％，基础豆油8％；ph为自然ph；灭菌条件121℃，0.11mpa，20min。
48.本实施例中进行100升发酵罐的放大，装量约为80升，以及一个灭过菌的无菌的储罐100ml进行收集鼠李糖脂发酵液泡沫，循环打入发酵罐中；具体操作如下：
49.1、取-80℃保存的甘油菌，按50ul菌液接种到lb平板培养基进行涂布，放在35℃培养箱中培养22小时；
50.2、将上述培养好的lb平板菌，挑取一个单菌落菌到lb摇瓶培养中进行培养，培养条件：37℃，220rpm，20h，得到lb摇瓶种子菌；
51.3、将上述lb摇瓶种子菌按照接种量为每瓶10ml转接到摇瓶种子培养基上进行在此扩大培养，培养条件为32℃，22h；
52.4、将得到的种子再转接到发酵培养基中进行培养得到终产物；在发酵培养过程中，不用控制ph；从发酵周期10h开始补豆油，按照每小时补入0.064升的速率，补到周期60h，然后停止补油，一共补入3.2升豆油，周期70h放罐。
53.由本次对比例1得到的鼠李糖脂发酵液中含有鼠李糖脂的浓度为45g/l。
54.实施例1与对比实施例1相比，该产量比对比例稳定提高了10g/l鼠李糖酯，不仅为今后鼠李糖酯工业化生控制产提供了放大的参数，也为能够工业化生产提供的技术平台。
55.以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述揭示的方法及技术内容作出些许的更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。