一种快速、灵敏诊断基因编辑牡蛎的HRM分析方法

一种快速、灵敏诊断基因编辑牡蛎的hrm分析方法
技术领域
1.本发明涉及快速筛选基因编辑水产动物的研究技术领域，更具体涉及一种基于高分辨率溶解曲线技术建立的基因编辑牡蛎的鉴别方法。


背景技术：

2.基因编辑是一种基因工程技术，可以在细胞和生物体基因组的特定位点进行修改、删除或插入一小段dna序列。crispr(簇状规则间隔的短回文重复序列)/cas9系统已经发展成为一种强大的基因编辑工具。随着这项技术的广泛应用，如何从基因编辑群体中快速、精准和高通量筛选设计的突变体显得尤为重要。迄今为止，已经有多种筛选技术，如聚合酶链式反应(pcr)/限制性内切酶(re)法、t7内切酶i(t7ei)法、surveyor核酸酶法、基于page的基因分型法和基于退火的临界温度pcr(act-pcr)分析法。但以上检测方法都存在耗时费力且需要靶位点序列特异性等局限性。
3.高分辨率熔解曲线(high-resolutionmelting，hrm)分析是在荧光定量pcr的基础上发展起来的突变筛查和分型技术，被广泛应用于未知基因突变筛选、snp分型、甲基化等研究。该技术的原理主要为由于dna序列的片段大小、gc含量和分布以及碱基互补性差异等的不同，会造成双链dna分子解链时tm值的不同。再利用荧光染料可以插入双链dna的特性和可精确控制温度的实时荧光定量pcr仪，监测温度变化过程中双链dna荧光染料与pcr扩增产物的结合情况生成高分辨率熔解曲线，就可以检测基因编辑后导致的单碱基变异、小插入或缺失等。并且，这是一种简单的闭管且无损的实验，因此后续可以将hrm分析后的产物直接通过克隆测序、凝胶电泳等下游分析的方法进行熔后dna样品回收。
4.牡蛎是我国具有非常重要经济价值的贝类，且具有世界性分布的特点。近年来，各国相继开展了牡蛎遗传育种，然而目前的育种工作还主要基于传统的人工选育方法，分子育种技术还并未得到实际应用。近年来，随着海洋贝类基因编辑技术的发展，牡蛎已经初步实现通过显微注射技术或电转技术对受精卵进行基因编辑系统的导入。然而，检测牡蛎基因编辑效率的方式主要通过大量直接测序进行筛选，这种方法仍然存在耗时、昂贵且流程繁琐等缺点。
5.本发明将hrm技术应用于筛选基因编辑牡蛎，相较于其他的检测手段，hrm分析可以在96孔的pcr板上进行高通量筛选，且不受突变类型和突变位点的限制，操作简单灵活，具有灵敏度高、特异性强和成本低廉等优点。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于提供一种快速、灵敏筛选基因编辑牡蛎的方法。
7.为实现上述目的，本方法公开如下的技术内容：一种基于hrm的分析方法，利用从单个g0代牡蛎幼虫中提取的gdna，高通量、快速且灵敏地筛选出基因编辑导致基因型突变的牡蛎个体。
8.进一步的，单个牡蛎幼虫gdna的提取用chelex-100树脂和蛋白酶k，并在55℃下孵
育2h，99℃灭活10min后，用移液枪吸取上清液。
9.进一步的，单个牡蛎幼虫为受精卵在22℃的海水中孵育24h的d型幼虫。
10.进一步的，hrm分析以提取的牡蛎幼虫gdna为模板，在靶位点附近设计扩增子小于200bp的特异性引物。
11.进一步的，特异性引物的扩增范围避开snp突变位点，且大小在100bp左右。
12.进一步的，为了更加稳定地收集荧光信号，将荧光剂和扩增酶混合，加入混合饱和性荧光染料。
13.进一步的，高通量且快速的一次性hrm分析可利用96孔板或384孔板上机，且hrm分析后的样品可应用于后续的克隆、测序等突变类型分析。
14.进一步的，hrm筛选g0代基因编辑牡蛎的灵敏度为10％(一个样品中突变牡蛎幼虫gdna浓度/所测样品gdna的总浓度为10％)。
15.本发明的优点和有益效果：1、本发明的筛选方法中，hrm检测不受突变碱基位点与类型局限，无需序列特异性探针，在pcr之后可直接用hrm检测，即可完成对样品突变的分析，省去了琼脂糖电泳等步骤，该方法具有操作简便快熟的优点。
16.2、本发明的筛选方法中，hrm引物易于高通量操作。pcr扩增产物可以在仪器上如lightcycler 480上，一次可以同时96个或384个样品直接分型，完成对突变体牡蛎的鉴定，因此较其他方法更加适用于高通量分析。
17.3、本发明的筛选方法中，该方法比克隆测序和t7e1酶检测都要节约成本，该方法具有成本低廉的优势。
18.4、利用本发明的方法辅助育种，方便、准确，节约成本，可以有效提高基因编辑牡蛎筛选效率。
附图说明
19.图1为实施例中，对长牡蛎tyr-2基因编辑的突变检测归一化高分辨率曲线。
20.图2为实施例中，对长牡蛎tyr基因编辑的突变检测归一化高分辨率曲线。
21.图3为实施例中，对hrm分析后的所有样品序列分析对比图。
具体实施方式
22.本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案，所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
23.以长牡蛎tyr-2和tyr基因为例，建立了筛选基因编辑牡蛎的hrm方法，下面做进一步详细阐述。
24.1)长牡蛎基因突变幼虫gdna和未编辑牡蛎幼虫gdna的获得分别针对长牡蛎靶基因tyr-2(geneid：105344040)和tyr(geneid：105329903)的第五个外显子和第二个外显子为靶位点，通过显微注射方法获取基因编辑的长牡蛎d型幼虫(受精卵孵育24h)，再利用chelex-100树脂和蛋白酶k，并在55℃下孵育2h，99℃灭活10min提取牡蛎幼虫的gdna。
25.2)特异性引物的选择
分别针对tyr-2和tyr的靶位点，设计了四条单链oligo特异性序列dna，扩增片段大小在100bp左右，其核苷酸序列如下所示：tyr-2f1:tgttatcatttgatccctcctatttatyr-2r1：ctgactggaccctttggaagattyr-f2：gaaactttgccgccaaaaacgtyr-r2：gaaactttgccgccaaaaacg3)pcr反应按照上述的特异性引物对供试样品模板dna进行pcr扩增(仪器为roche480)，其中pcr的总体积为20μl，扩增反应体系为：primer f(2.5μm)1.4μlprimer r(2.5μm)1.4μldna(至少5ng/μl)2μlfluorescent dyes(evagreen mix，abi)10μlddh2o 5.2μltotal 20μl4)pcr反应程序：95℃预变性5min；95℃变性40s，touchdown设置为第一个循环在62℃下退火延伸40s，之后每个循环降低0.5℃，退火延伸10个循环，72℃延伸40s；循环55次；熔解曲线由60～90℃加热样品生成，每度采集25次数据。
26.5)在整个加热过程中监测荧光，并通过检测480软件的“gene scanning”分析模块的归一化熔解曲线、温度偏移熔解曲线和熔解峰值，确定基因编辑成功的牡蛎个体。
27.6)为验证该方法的准确性，将hrm分析后的pcr产物直接送至测序公司进行纯化并测序。该步骤只为验证hrm方法的准确性，实际筛选中，可根据实际情况选择性的采取该步骤。