玉米鞘氨醇激酶ZmSphK1基因的克隆及在盐胁迫中的应用

本发明属于玉米基因克隆，具体涉及一种玉米鞘氨醇激酶zmsphk1基因的克隆在盐胁迫中的应用

背景技术：

1、作为人们主要的粮食作物及饲料来源之一的玉米，因其广泛的应用价值及低廉的成本，一直受到世界各国学者的重视和青睐。在我国，玉米已成为三大作物中总产量最高、种植面积最大、单产仅次于水稻的重要作物。然而，玉米对盐胁迫的耐受性是很弱的。当处于盐胁迫下，植株的生长会受到抑制，净光合速率、叶绿素含量和根系活力明显降低，且对地上部的影响大于对地下部的影响。过高的盐浓度可能导致玉米生长迟缓、作物减产甚至大面积枯萎。所以，玉米耐盐性的研究，对于提高玉米产量、培育优良耐性品种有重要意义。

2、膜脂的重要组成部分——鞘磷脂，其代谢产物鞘磷脂-1-磷酸(s1p)在动物细胞中是一种非常有效的脂质介导物，在动物系统的多个生物学过程中起到重要的作用。而鞘氨醇激酶(sphk)是s1p合成所需要的关键的酶，鞘氨醇在鞘氨醇激酶的催化下形成s1p。鞘氨醇激酶是一类新的脂类激酶，该酶具有高度的进化保守性,在人、小鼠、酵母和植物中有表达，在线虫和果蝇中有类似激酶存在。在哺乳动物中已经鉴定有sphk和sphk2这两种鞘氨醇激酶存在。根据近年研究发现，在植物体中也有s1p的存在，除了对植物的生长发育过程有作用以外，在逆境胁迫中也起到了必不可少的作用。最近已经被证明的是，合成s1p的酶——鞘氨醇激酶(sphk)，是由拟南芥(arabidopsis thaliana)保护细胞中的植物激素脱落酸刺激产生的；s1p能有效地调控保护细胞的开闭。近年研究指出，s1p可能参与了植物体内的多种信号转导途径：①植物在对非生物胁迫时，其抗逆性与适应性主要取决于植物激素脱落酸(aba)的控制，而s1p能参与aba介导的干旱信号转导途径；②钙离子作为许多逆境胁迫的第二信使，对于植物体来说能产生提高抗逆性的非常好的作用。而s1p能参与调节植物体内钙离子浓度，并且可能在保卫细胞的信号转导过程中起作用，它可以通过引起钙离子浓度变化而影响气孔的开闭，s1p引起的气孔关闭程度与其在细胞体内的剂量呈现出特异性，高浓度引起的效应更快。然而,在植物抵抗盐胁迫时，s1p如何起作用，到目前为止仍然不清楚。研究植物抗逆系统中的各种酶，从而为植物抵抗逆境胁迫提供一个良好的育种策略，是目前研究的热点。为此，我们克隆鉴定了玉米中s1p合成和代谢有关的鞘氨醇激酶基因zmsphk1。

技术实现思路

1、本发明提供了一种玉米鞘氨醇激酶zmsphk1基因克隆、克隆方法，可以有效克隆和表达玉米zmsphk1基因。

2、第一个目的是提供一种玉米鞘氨醇激酶zmsphk1基因的克隆方法，具体步骤为：

3、(1)材料的准备与处理：玉米自交系品种“1104”、品种“mo17”由分子育种实验室提供。将营养土以及蛭石按照适量的比例混合后，挑选籽粒饱满的种子各10粒进行种植，将剪取的叶片放在超低温冰箱中保存以供rna提取使用；

4、(2)玉米叶片的总rna的提取：本实验采用takara rna提取试剂盒提取叶片的rna，此外还需要dnaseⅰ反应去除所提rna中的dna污染。整个的提取过程都应该在冰上进行操作，并且佩戴口罩；

5、(3)反转录成cdna及实时荧光定量pcr(rt-pcr)：本实验采用takara的反转录试剂盒进行cdna的合成，20μl的反应体系中加入4μl的rna。按照设定的反应程序进行反转录，之后将反转录产物于-20℃低温冰箱中保存备用；用荧光定量real-time rt-pcr对zmsphk1基因的表达进行分析，其方法如下：荧光定量pcr所用仪器为qiagen公司的型号为rotor-geneq荧光定量pcr仪器。所用的试剂盒tb greentmpermix ex taqtmⅱ(takara cat#rr820a)。参照说明书配置25μl体系的pcr原液；pcr反应程序如下：94℃预变性5min；94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；4℃保存。反应结束后，数据分析应用2^δδct法[12]，即：

6、fold change＝2-[(ct处理-ct处理actin)-(ct对照-ct对照actin)]

7、根据此表达式，可以初步判断zmsphk1基因表达量的大致变化。

8、(4)基因克隆：

9、合成引物：zm-zmsphk1-f：5’-gatgcaagaaaccaagcatcgg-3’；zm-zmsphk1-r：5’-attcaaggcgagcacttccc-3’

10、使用步骤3反转录的cdna为模板进行pcr扩增，pcr扩增体系为：2×gc bufferⅱ25μl、dntp 8μl、zm-zmsphk1-f1 1μl、zm-zmsphk1-r1 1μl、cdna模板2μl、la taq酶0.5μl、ddh2o 12.5μl；

11、pcr结束后琼脂糖凝胶电泳，回收约1100bp的条带，即获得玉米鞘氨醇激酶zmsphk1基因。

12、一种玉米鞘氨醇激酶zmsphk1基因的在盐胁迫中的应用

13、本发明的第二个目的是为了提供一种所述的玉米鞘氨醇激酶zmsphk1基因的应用方法，具体为以下步骤：

14、s1,pmd19-zmzmsphk1重组质粒的构建：连接所述的玉米基因zmzmsphk1的克隆与pmd19-t载体，对纯化的基因zmzmsphk1的克隆与pmd19-t载体连接，得到重组质粒pmd19-zmzmsphk1；

15、s2,原核表达载体pet28a-zmsphk1的构建：以zmzmsphk1-xbaⅰ-f和zmzmsphk1-bamhi-r作为引物，以测序正确的pmd19-t-zmzmsphk1质粒作为模板进行pcr扩增，切胶后纯化回收目的片段。把pet28a表达载体的质粒用限制性内切酶xba i和bamhi进行双酶切。双酶切完成以后进行琼脂糖凝胶电泳，并将目的片段切胶回收，将pcr产物和pet28a表达载体胶回收后的产物dna进行连接反应。得到植物表达载体pet28a-zmzmsphk1；

16、s3,植物表达载体pcambia1300-zmzmsphk1的构建：以zmzmsphk1-xbai-f和zmzmsphk1-bamhi-r作为引物，以测序正确的pmd19-t-zmzmsphk1质粒作为模板进行pcr扩增，切胶后纯化回收目的片段。把pcambia1300表达载体的质粒用限制性内切酶xba i和bamhi进行双酶切。双酶切完成以后进行琼脂糖凝胶电泳，并将目的片段切胶回收，将pcr产物和pcambia1300表达载体胶回收后的产物dna进行连接反应。得到植物表达载体pcambia1300-zmzmsphk1；

17、s4,农杆菌侵染植株：种植野生型拟南芥，制备农杆菌感受态细胞，然后用植物表达载体pcambia1300-zmzmsphk1转化农杆菌感受态细胞，利用农杆菌侵染拟南芥，得到能有效克隆玉米zmzmsphk1基因的转基因植株。

18、本发明中所述的农杆菌为农杆菌gv3101。

19、将s4中所述的农杆菌侵染植物体后，经过三代自交后筛选出含有zmsphk1基因的植物体。

20、本发明提供了一种玉米鞘氨醇激酶zmsphk1基因的克隆及应用方法，可以有效的克隆和表达玉米鞘氨醇激酶zmsphk1基因，本发明还发现zmsphk1基因在原核表达产物以及真核表达产物使过表达植株抵抗盐胁迫的能力增强。

21、本发明的zmsphk1基因的序列长1044bp，编码区长1029bp，共编码342个氨基酸。

22、本发明的zmsphk1基因在http://web.expasy.org/protparam/网站通过protparam预测zmsphk1基因编码的蛋白质分子量为37192.41kda，理论等电点为5.58；负电荷残基(asp+glu)总数为42个，正电荷残基(arg+lys)总数是35个；不稳定系数为38.25，表现为较稳定。

23、本发明的zmsphk1基因，使用bioxm2.6软件对测序结果与zmsphk1目的基因(loc100383275)进行序列比对，序列_0为zmsphk1目的基因，序列_1为测序结果，如序列表中序列1。

24、本发明的zmsphk1基因，登陆ncbi网站上利用blast寻找植物种间同源序列并使用mega5.0软件对蛋白序列进行alignment，并进行遗传进化分析，结果如图1所示，表示和ncbi查询到的玉米序列一致。

25、本发明从玉米中扩增zmsphk1基因全长cdna,并在此基础上克隆得到基因zmsphk1,将其连接于植物表达载体上,并利用农杆菌侵染法转化拟南芥，数据显示该基因能够显著提高转基因拟南芥在种子萌发期及壮苗期的耐盐性。本发明所述的基因可为培育农作物新品种提供理论依据和基因来源,有助于从根本上改善玉米作物的耐盐性能。