1.本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种无血清低氧培养间充质干细胞的方法。
背景技术：
2.间充质干细胞是一种多能干细胞，它具有干细胞的所有共性，即自我更新和多向分化能力。在临床应用也最多，与造血干细胞联合应用，可以提高移植的成功率，加速造血重建。当患者接受大剂量化疗后，将间充质干细胞与造血干细胞一同输入，可明显加速患者血细胞恢复时间，且安全无不良反应。间充质干细胞不仅存在于骨髓中，也存在于骨骼肌、骨外膜和骨小梁中。由于它分化的组织类型十分广泛，因此临床应用价值不菲。
3.现有的无血清低氧培养后的间充质干细胞的增殖倍数和细胞活率均较低，限制了无血清低氧培养效率，基于此，本发明提供一种无血清低氧培养间充质干细胞的方法。
技术实现要素：
4.针对现有技术的缺陷，本发明的目的是提供一种无血清低氧培养间充质干细胞的方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
5.本发明解决技术问题采用如下技术方案：
6.本发明提供了一种无血清低氧培养间充质干细胞的方法，包括以下步骤：
7.s1、取原代人脐带间充质干细胞按3000个/ml的细胞密度接种于15cm的培养皿中，再置于饱和湿度培养箱中培养，每隔3d进行全量换液，待原代人脐带间充质干细胞生长至80％融合时，使用重组酶消化后进行传代培养，传至p5代；
8.s2、收集p5代细胞进行流式细胞仪检测，人脐带间充质干细胞高表达cd105、cd90、cd73；cd34、cd45和hla-dr的表达量低于0.05％，表明培养的细胞具有间充质干细胞的基本特征。
9.优选地，所述培养皿由基础培养基、添加剂成分组成。
10.优选地，所述基础培养基成分包括以下重量份原料：
11.无水氯化钙200mg/l、硝酸铁9h2o 0.1mg/l、氯化钾400mg/l、无水硫酸镁97.67mg/l、氯化钠6400mg/l、无水磷酸二氢钠125mg/l、l-盐酸精氨酸84mg/l、l-盐酸胱氨酸63mg/l、l-谷氨酰胺584mg/l、甘氨酸30mg/l、l-盐酸组氨酸42mg/l、l-异亮氨酸105mg/l、l-亮氨酸105mg/l、l-盐酸赖氨酸146mg/l、l-甲硫氨酸30mg/l、l-苯丙胺酸66mg/l、l-丝氨酸42mg/l、l-苏氨酸95mg/l、l-色氨酸16mg/l、l-酪氨酸钠盐104mg/l、l-缬氨酸94mg/l、d-泛酸钙4mg/l、氯化胆碱4mg/l、叶酸4mg/l、肌醇7.2mg/l、烟酰胺4mg/l、核黄素0.4mg/l、盐酸硫胺4mg/l、盐酸吡哆辛4mg/l、葡萄糖1000mg/l、丙酮酸钠110mg/l。
12.优选地，所述添加剂成分包括以下重量份原料：
13.1-3％血小板裂解物、1-3％人血白蛋白、1-3μg/ml重组胰岛素、10-20ng/ml egf、10-20ng/ml bfgf、丝素蛋白0.0075-0.0085mg/l、羧甲基纤维素钠0.005-0.006mg/l、大豆低聚肽0.010-0.012mg/l、3-吡啶甲酸0.0135-0.0140mg/l、辅酶q10 0.01-0.02mg/l、α-酮
戊二酸0.0085-0.0090mg/l、微量元素0.025-0.030mg/l。
14.优选地，所述添加剂成分包括以下重量份原料：
15.1％血小板裂解物、1％人血白蛋白、2μg/ml重组胰岛素、15ng/ml egf、15ng/ml bfgf、丝素蛋白0.0085mg/l、羧甲基纤维素钠0.006mg/l、大豆低聚肽0.012mg/l、3-吡啶甲酸0.0135mg/l、辅酶q10 0.01mg/l、α-酮戊二酸0.0085mg/l、微量元素0.025mg/l。
16.优选地，所述微量元素为镁、铁、锌、硒中的一种或多种组合物。
17.优选地，所述饱和湿度培养箱的条件为：37℃，5％co2的低氧培养条件。
18.与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：
19.本发明低氧培养人脐带间充质干细胞的方法对间充质干细胞的培养效果更好，培养后的间充质干细胞的增殖倍数和细胞活率都更优于常氧培养；羧甲基纤维素钠、丝素蛋白，可提高细胞的粘附性，利于细胞固着，促进细胞生长；大豆低聚肽和辅酶q10具有较好的抗氧化作用，促进细胞代谢，提高细胞内酶的活性，α-酮戊二酸和3-吡啶甲酸协同作用，调节蛋白质的代谢，促进蛋白的合成，提高细胞生长速度和增殖数量，提高细胞分泌生长因子的性能；微量元素提供更好的营养环境，进一步促进细胞生长，提高细胞活性。
具体实施方式
20.下面结合具体实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
21.本实施例的一种无血清低氧培养间充质干细胞的方法，包括以下步骤：
22.s1、取原代人脐带间充质干细胞按3000个/ml的细胞密度接种于15cm的培养皿中，再置于饱和湿度培养箱中培养，每隔3d进行全量换液，待原代人脐带间充质干细胞生长至80％融合时，使用重组酶消化后进行传代培养，传至p5代；
23.s2、收集p5代细胞进行流式细胞仪检测，人脐带间充质干细胞高表达cd105、cd90、cd73；cd34、cd45和hla-dr的表达量低于0.05％，表明培养的细胞具有间充质干细胞的基本特征。
24.本实施例的培养皿由基础培养基、添加剂成分组成。
25.本实施例的基础培养基成分包括以下重量份原料：
26.无水氯化钙200mg/l、硝酸铁9h2o 0.1mg/l、氯化钾400mg/l、无水硫酸镁97.67mg/l、氯化钠6400mg/l、无水磷酸二氢钠125mg/l、l-盐酸精氨酸84mg/l、l-盐酸胱氨酸63mg/l、l-谷氨酰胺584mg/l、甘氨酸30mg/l、l-盐酸组氨酸42mg/l、l-异亮氨酸105mg/l、l-亮氨酸105mg/l、l-盐酸赖氨酸146mg/l、l-甲硫氨酸30mg/l、l-苯丙胺酸66mg/l、l-丝氨酸42mg/l、l-苏氨酸95mg/l、l-色氨酸16mg/l、l-酪氨酸钠盐104mg/l、l-缬氨酸94mg/l、d-泛酸钙4mg/l、氯化胆碱4mg/l、叶酸4mg/l、肌醇7.2mg/l、烟酰胺4mg/l、核黄素0.4mg/l、盐酸硫胺4mg/l、盐酸吡哆辛4mg/l、葡萄糖1000mg/l、丙酮酸钠110mg/l。
27.本实施例的添加剂成分包括以下重量份原料：
28.1-3％血小板裂解物、1-3％人血白蛋白、1-3μg/ml重组胰岛素、10-20ng/ml egf、10-20ng/ml bfgf、丝素蛋白0.0075-0.0085mg/l、羧甲基纤维素钠0.005-0.006mg/l、大豆
低聚肽0.010-0.012mg/l、3-吡啶甲酸0.0135-0.0140mg/l、辅酶q10 0.01-0.02mg/l、α-酮戊二酸0.0085-0.0090mg/l、微量元素0.025-0.030mg/l。
29.本实施例的添加剂成分包括以下重量份原料：
30.1％血小板裂解物、1％人血白蛋白、2μg/ml重组胰岛素、15ng/ml egf、15ng/ml bfgf、丝素蛋白0.0085mg/l、羧甲基纤维素钠0.006mg/l、大豆低聚肽0.012mg/l、3-吡啶甲酸0.0135mg/l、辅酶q10 0.01mg/l、α-酮戊二酸0.0085mg/l、微量元素0.025mg/l。
31.本实施例的微量元素为镁、铁、锌、硒中的一种或多种组合物。
32.本实施例的饱和湿度培养箱的条件为：37℃，5％co2的低氧培养条件。
33.实施例1.
34.本实施例的一种无血清低氧培养间充质干细胞的方法，包括以下步骤：
35.s1、取原代人脐带间充质干细胞按3000个/ml的细胞密度接种于15cm的培养皿中，再置于饱和湿度培养箱中培养，每隔3d进行全量换液，待原代人脐带间充质干细胞生长至80％融合时，使用重组酶消化后进行传代培养，传至p5代；
36.s2、收集p5代细胞进行流式细胞仪检测，人脐带间充质干细胞高表达cd105、cd90、cd73；cd34、cd45和hla-dr的表达量低于0.05％，表明培养的细胞具有间充质干细胞的基本特征。
37.本实施例的培养皿由基础培养基、添加剂成分组成。
38.本实施例的基础培养基成分包括以下重量份原料：
39.无水氯化钙200mg/l、硝酸铁9h2o 0.1mg/l、氯化钾400mg/l、无水硫酸镁97.67mg/l、氯化钠6400mg/l、无水磷酸二氢钠125mg/l、l-盐酸精氨酸84mg/l、l-盐酸胱氨酸63mg/l、l-谷氨酰胺584mg/l、甘氨酸30mg/l、l-盐酸组氨酸42mg/l、l-异亮氨酸105mg/l、l-亮氨酸105mg/l、l-盐酸赖氨酸146mg/l、l-甲硫氨酸30mg/l、l-苯丙胺酸66mg/l、l-丝氨酸42mg/l、l-苏氨酸95mg/l、l-色氨酸16mg/l、l-酪氨酸钠盐104mg/l、l-缬氨酸94mg/l、d-泛酸钙4mg/l、氯化胆碱4mg/l、叶酸4mg/l、肌醇7.2mg/l、烟酰胺4mg/l、核黄素0.4mg/l、盐酸硫胺4mg/l、盐酸吡哆辛4mg/l、葡萄糖1000mg/l、丙酮酸钠110mg/l。
40.本实施例的添加剂成分包括以下重量份原料：
41.1％血小板裂解物、1％人血白蛋白、1μg/ml重组胰岛素、10ng/ml egf、10ng/ml bfgf、丝素蛋白0.0075mg/l、羧甲基纤维素钠0.005mg/l、大豆低聚肽0.010mg/l、3-吡啶甲酸0.0135mg/l、辅酶q10 0.0mg/l、α-酮戊二酸0.0085mg/l、微量元素0.025mg/l。
42.本实施例的微量元素为镁。
43.本实施例的饱和湿度培养箱的条件为：37℃，5％co2的低氧培养条件。
44.实施例2.
45.本实施例的一种无血清低氧培养间充质干细胞的方法，包括以下步骤：
46.s1、取原代人脐带间充质干细胞按3000个/ml的细胞密度接种于15cm的培养皿中，再置于饱和湿度培养箱中培养，每隔3d进行全量换液，待原代人脐带间充质干细胞生长至80％融合时，使用重组酶消化后进行传代培养，传至p5代；
47.s2、收集p5代细胞进行流式细胞仪检测，人脐带间充质干细胞高表达cd105、cd90、cd73；cd34、cd45和hla-dr的表达量低于0.05％，表明培养的细胞具有间充质干细胞的基本特征。
48.本实施例的培养皿由基础培养基、添加剂成分组成。
49.本实施例的基础培养基成分包括以下重量份原料：
50.无水氯化钙200mg/l、硝酸铁9h2o 0.1mg/l、氯化钾400mg/l、无水硫酸镁97.67mg/l、氯化钠6400mg/l、无水磷酸二氢钠125mg/l、l-盐酸精氨酸84mg/l、l-盐酸胱氨酸63mg/l、l-谷氨酰胺584mg/l、甘氨酸30mg/l、l-盐酸组氨酸42mg/l、l-异亮氨酸105mg/l、l-亮氨酸105mg/l、l-盐酸赖氨酸146mg/l、l-甲硫氨酸30mg/l、l-苯丙胺酸66mg/l、l-丝氨酸42mg/l、l-苏氨酸95mg/l、l-色氨酸16mg/l、l-酪氨酸钠盐104mg/l、l-缬氨酸94mg/l、d-泛酸钙4mg/l、氯化胆碱4mg/l、叶酸4mg/l、肌醇7.2mg/l、烟酰胺4mg/l、核黄素0.4mg/l、盐酸硫胺4mg/l、盐酸吡哆辛4mg/l、葡萄糖1000mg/l、丙酮酸钠110mg/l。
51.本实施例的添加剂成分包括以下重量份原料：
52.3％血小板裂解物、3％人血白蛋白、3μg/ml重组胰岛素、20ng/ml egf、20ng/ml bfgf、丝素蛋白0.0085mg/l、羧甲基纤维素钠0.006mg/l、大豆低聚肽0.012mg/l、3-吡啶甲酸0.0140mg/l、辅酶q10 0.02mg/l、α-酮戊二酸0.0090mg/l、微量元素0.030mg/l。
53.本实施例的微量元素为锌。
54.本实施例的饱和湿度培养箱的条件为：37℃，5％co2的低氧培养条件。
55.实施例3.
56.本实施例的一种无血清低氧培养间充质干细胞的方法，包括以下步骤：
57.s1、取原代人脐带间充质干细胞按3000个/ml的细胞密度接种于15cm的培养皿中，再置于饱和湿度培养箱中培养，每隔3d进行全量换液，待原代人脐带间充质干细胞生长至80％融合时，使用重组酶消化后进行传代培养，传至p5代；
58.s2、收集p5代细胞进行流式细胞仪检测，人脐带间充质干细胞高表达cd105、cd90、cd73；cd34、cd45和hla-dr的表达量低于0.05％，表明培养的细胞具有间充质干细胞的基本特征。
59.本实施例的培养皿由基础培养基、添加剂成分组成。
60.本实施例的基础培养基成分包括以下重量份原料：
61.无水氯化钙200mg/l、硝酸铁9h2o 0.1mg/l、氯化钾400mg/l、无水硫酸镁97.67mg/l、氯化钠6400mg/l、无水磷酸二氢钠125mg/l、l-盐酸精氨酸84mg/l、l-盐酸胱氨酸63mg/l、l-谷氨酰胺584mg/l、甘氨酸30mg/l、l-盐酸组氨酸42mg/l、l-异亮氨酸105mg/l、l-亮氨酸105mg/l、l-盐酸赖氨酸146mg/l、l-甲硫氨酸30mg/l、l-苯丙胺酸66mg/l、l-丝氨酸42mg/l、l-苏氨酸95mg/l、l-色氨酸16mg/l、l-酪氨酸钠盐104mg/l、l-缬氨酸94mg/l、d-泛酸钙4mg/l、氯化胆碱4mg/l、叶酸4mg/l、肌醇7.2mg/l、烟酰胺4mg/l、核黄素0.4mg/l、盐酸硫胺4mg/l、盐酸吡哆辛4mg/l、葡萄糖1000mg/l、丙酮酸钠110mg/l。
62.本实施例的添加剂成分包括以下重量份原料：
63.2％血小板裂解物、2％人血白蛋白、2μg/ml重组胰岛素、15ng/ml egf、15ng/ml bfgf、丝素蛋白0.0080mg/l、羧甲基纤维素钠0.0055mg/l、大豆低聚肽0.011mg/l、3-吡啶甲酸0.0137mg/l、辅酶q10 0.015mg/l、α-酮戊二酸0.0087mg/l、微量元素0.028mg/l。
64.本实施例的微量元素为硒。
65.本实施例的饱和湿度培养箱的条件为：37℃，5％co2的低氧培养条件。
66.羧甲基纤维素钠、丝素蛋白，可提高细胞的粘附性，利于细胞固着，促进细胞生长；
大豆低聚肽和辅酶q10具有较好的抗氧化作用，促进细胞代谢，提高细胞内酶的活性，α-酮戊二酸和3-吡啶甲酸协同作用，调节蛋白质的代谢，促进蛋白的合成，提高细胞生长速度和增殖数量，提高细胞分泌生长因子的性能；微量元素提供更好的营养环境，进一步促进细胞生长，提高细胞活性。
67.取原代人脐带间充质干细胞按3000个/ml的细胞密度接种于15cm的培养皿中，再置于37℃，5％co2饱和湿度培养箱中培养，每隔3d进行全量换液，待原代人脐带间充质干细胞生长至80％融合时，使用重组酶消化后进行传代培养，传至p5代。
68.收集p5代细胞进行流式细胞仪检测，人脐带间充质干细胞高表达cd105、cd90、cd73；cd34、cd45和hla-dr的表达量低于0.05％，表明培养的细胞具有间充质干细胞的基本特征。
69.标记抗体阳性比率(％)cd10599.10cd9099.43cd7398.96cd340.26cd450.23hla-dr0.19
70.常氧组：取原代人脐带间充质干细胞按3000个/ml的细胞密度接种于15cm的培养皿中，再置于37℃，21％o2 5％co2培养箱中培养，将原代脐带来源间充质干细胞在培养箱中培养96h，且在培养过程中，每72h(3天)更换一次培养基，培养结束后，收集培养所得的间充质干细胞。
71.低氧组：取原代人脐带间充质干细胞按3000个/ml的细胞密度接种于15cm的培养皿中，再置于37℃，3％o2 5％co2培养箱中培养，将原代脐带来源间充质干细胞在培养箱中培养96h，且在培养过程中，每72h(3天)更换一次培养基，培养结束后，收集培养所得的间充质干细胞。
[0072] 增殖倍数/1细胞活率/％常氧培养43.6296.01低氧培养68.2799.62
[0073]
低氧培养人脐带间充质干细胞的方法对间充质干细胞的培养效果更好，培养后的间充质干细胞的增殖倍数和细胞活率都更优于常氧培养。
[0074]
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
[0075]
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。