一种基于聚苯乙烯微球的金黄色葡萄球菌模拟剂及其制备方法

1.本发明涉及生物气溶胶防护技术领域，特别涉及一种基于聚苯乙烯微球的金黄色葡萄球菌模拟剂及其制备方法。


背景技术：

2.生物气溶胶是由任何种类的生物颗粒组成的气溶胶，空气动力学直径为100μm或更小。生物气溶胶的特性因环境影响而不同，如湿度、气流和温度。气溶胶便于空气中微生物的空气传播，由称为液滴核(1-100μm)或液滴(》100μm)的小颗粒组成；飞沫核可以在空气中停留几个小时，远距离传输，并通过下落污染环境表面。已经证明，液滴可以污染1米范围内的表面。生物气溶胶已被证明含有流感或鼻病毒、结核分枝杆菌、金黄色葡萄球菌、水痘带状疱疹病毒、链球菌属或曲霉菌属，生物气溶胶在空气中的扩散和传播有可能造成人类之间、以及人与动物之间的流行病传播。
3.为了有效地对大气中的生物气溶胶进行及时预警和防护，需要对生物气溶胶的种类进行识别。但在生物气溶胶监测和防护装备的性能测试中，使用具有感染性的微生物气溶胶开展试验存在安全风险。因此，寻找可有效替代感染性微生物气溶胶的物质成为现阶段亟需解决的技术问题。金黄色葡萄球菌是导致医院获得性感染和食源性疾病的最常见原因之一，也是生物气溶胶的重要构成之一。金黄色葡萄球菌的毒素和剧毒的蛋白酶通常在宿主的血管中循环，导致发生威胁生命的疾病，典型的金黄色葡萄球菌为球型，直径0.8μm左右。如何构建具有典型金黄色葡萄球菌特征的生物气溶胶成为亟需解决的技术问题。


技术实现要素：

4.基于上述本发明所要解决的技术问题，本发明采用分散聚合法和系列筛分技术获得了直径与金黄色葡萄球菌相似的高单分散聚苯乙烯荧光微球，提出了一种基于聚苯乙烯微球的金黄色葡萄球菌模拟剂及其制备方法，本发明所述模拟剂在粒径、荧光特征信号和气溶胶模拟等方面均可有效模拟金黄色葡萄球菌。
5.本发明的目的之一，是提供一种基于聚苯乙烯微球的金黄色葡萄球菌模拟剂，所述模拟剂为高单分散微米-亚微米聚合物微球；所述模拟剂包括氯甲基化聚苯乙烯微球。
6.进一步地，所述模拟剂直径为0.7μm～0.9μm。
7.进一步地，所述模拟剂cv值为3.0％～7.0％。
8.本发明的目的之二，是提供一种基于聚苯乙烯微球的金黄色葡萄球菌模拟剂的制备方法，包括：
9.s1、在乙醇和水溶液中加入聚乙烯吡咯烷酮、偶氮二异丁腈和苯乙烯，将配制好的乙醇溶液溶解后放入加热磁力搅拌器中，通入氮气排除系统中的氧气，打开加热磁力搅拌器进行聚合反应，得到聚苯乙烯亚微米级微球分散体，离心收集；用无水乙醇悬浮，加入氨基硅烷，搅拌后用无水乙醇洗涤，收集；
10.s2、将聚苯乙烯微球在氯甲基甲醚中溶胀，向混合物中加入三氯化铝；在40℃～60℃下搅拌，通过离心收集微球，并用丙酮、盐酸溶液、无水乙醇和去离子水多次洗涤；离心收集，离心后悬浮于无水乙醇溶液中，加入氨基硅烷，室温下搅拌，用无水乙醇洗涤并收集，得到稳定的荧光微球；
11.s3、配制具有梯度质量比的甘油/水溶液，计算其密度和粘度；将制备的聚苯乙烯微球样品加入到甘油/水溶液，确定微球可在溶液中长时间悬浮时的甘油/水质量比，水溶液的密度和微球的密度相同；更换甘油/水质量比溶液，根据公式计算目标微球沉降到底部所需的时间，沉降样品，达到计算的时间后，去除上层小微球，重复数次至上层接近澄清；再次沉降样品，在计算时间前，收集上层液体微球，去除底物微球，重复数次，至底物无明显微球沉淀为止，得到目标粒径的微球；
12.所述下沉时间的计算公式包括：
13.其中，d为微球下降距离，v为微球运动速度，μ为水相的动态粘度，r为一个微球的半径，g为重力加速度，ρ
液
为水溶液密度，ρ
球
为微球密度；
14.当ρ液和ρ球不相等时，微球在溶液中有上浮或沉降；当微球的密度小于水溶液的密度时，聚合物微球在水相中上浮；当微球密度精确等于水溶液的密度时，微球能够稳定的悬浮在溶液中；当微球的密度大于水溶液的密度时，微球将沉降到瓶子的底部；
15.s4、使用超滤离心管对聚苯乙烯微球进一步筛选，将s3中得到的目标粒径的微球加入超滤离心管中，经离心，用乙醇重悬上层过滤器中的微球，得到目标粒径微球；
16.s5、将单分散聚苯乙烯微球雾化，形成浓度均匀稳定的气溶胶环境，得到基于聚苯乙烯微球的金黄色葡萄球菌模拟剂。
17.进一步地，所述s1中，所述聚乙烯吡咯烷酮含量为1wt％～5wt％，所述偶氮二异丁腈含量为0.6wt％～1.4wt％，所述苯乙烯含量为6wt％～14wt％，所述水:乙醇＝0～1:4，所述反应温度为60℃～80℃。
18.进一步地，所述s1中，所述聚乙烯吡咯烷酮含量为2wt％～4wt％，所述偶氮二异丁腈含量为0.8wt％～1.2wt％，所述苯乙烯含量为8wt％～12wt％，所述水:乙醇＝0～1:4，所述反应温度为65℃～75℃。
19.进一步地，所述模拟剂平均粒径为711nm～755nm。
20.进一步地，所述模拟剂在400nm～500nm范围内产生一个宽的荧光发射峰，最大荧光发射峰分别稳定在435nm～443nm和458nm～466nm。
21.进一步地，所述模拟剂的荧光寿命至少180天保持稳定。
22.进一步地，所述模拟剂可模拟生物气溶胶中的金黄色葡萄球菌。
23.与现有技术相比，本发明提出了一种基于聚苯乙烯微球的金黄色葡萄球菌模拟剂及其制备方法，具备以下有益效果：
24.1.本发明所提出的基于聚苯乙烯微球的金黄色葡萄球菌模拟剂，与真实金黄色葡萄球菌开展对比试验，证明了本发明所制备的微球在粒径、荧光特征信号和气溶胶模拟等方面均可有效模拟金黄色葡萄球菌，可在生物气溶胶监测和防护装备的模拟测试方面得到广泛应用。
25.2.本发明采用分散聚合法和系列筛分技术获得了直径为0.7μm～0.9μm的高单分
散聚苯乙烯荧光微球，为高单分散性微球，cv值达到3.0％～7.0％。
26.3.本发明制备得到的基于聚苯乙烯微球的金黄色葡萄球菌模拟剂，具有可控性好、稳定性高、毒性低、操作简便的特点。
附图说明
27.图1示出了本发明实施例的一种不同的st浓度对聚苯乙烯微球的平均粒径和变化系数的影响；a：聚苯乙烯微球的平均粒径和变化系数的统计图；b：st浓度为6wt％时，聚苯乙烯微球的sem图像；c：st浓度为10wt％时，聚苯乙烯微球的sem图像；d：st浓度为14wt％时，聚苯乙烯微球的sem图像；
28.图2示出了本发明实施例的一种不同pvp浓度对聚苯乙烯微球粒径和变异系数的影响；a：聚苯乙烯微球的平均粒径和变化系数的统计图；b：pvp浓度为3wt％时，聚苯乙烯微球的sem图像；
29.图3示出了本发明实施例的一种不同筛分方法对微球粒径分散性的影响；a：聚苯乙烯微球粗产物；b：梯度沉降法筛分微球；c：梯度沉降法和650nm超滤离心管筛分微球；
30.图4示出了本发明实施例的一种金黄色葡萄球菌和聚苯乙烯微球的荧光发射光谱比较图；
31.图5示出了本发明实施例的一种聚苯乙烯微球0天(左)和180天(右)的荧光寿命比较图；
32.图6示出了本发明实施例的一种金黄色葡萄球菌和聚苯乙烯微球在气溶胶中的粒径分布比较图。
具体实施方式
33.下面将参照附图更详细地描述本技术的示例性实施例。虽然附图中显示了本技术的示例性实施例，然而应当理解，可以以各种形式实现本技术而不应被这里阐述的实施例所限制。相反，提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本技术，并且能够将本技术的范围完整地传达给本领域的技术人员。
34.下述实施例中，若未特别指明，所采用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，本发明中的试剂和材料为市场或其他公共渠道获得。
35.本发明所涉实验原料和设备主要包括但不限于：
36.试剂：2,2-偶氮二异丁腈(a104255,aladdin)，2,2-偶氮二异丁腈(a104256,aladdin)，苯乙烯(s817904,macklin)，聚乙烯吡咯烷酮(p274371,aladdin),无水乙醇(ar,kermel)，氯甲基甲醚(107-30-2,郑州万象精细化工有限公司)，三氯化铝(206911，sigma-aldrich)，盐酸溶液(w530574,sigma-aldrich)，065μm low-binding durapore pvdf membrane(ufc40dv25,merck)，丙酮(48358,supelco)；
37.仪器：集热式恒温加热磁力搅拌器(df-101s,巩义市予华仪器有限责任公司)，低温恒温循环水槽(n1-2rc,bioer)，高速大容量离心机(cr22g,hitachi)。
38.本发明所述的荧光染色，主要通过friedel-crafts烷基化制备氯甲基化聚苯乙烯微球；将5g聚苯乙烯微球在50ml氯甲基甲醚中溶胀60分钟，然后向混合物中加入1.2wt％三氯化铝；在50℃下搅拌12小时后，通过离心收集微球，并用丙酮、盐酸溶液、无水乙醇和去离
子多次洗涤。
39.本发明的技术原理主要包括：
40.采用分散聚合法和系列筛分技术获得了直径与金黄色葡萄球菌相似的高单分散聚苯乙烯荧光微球，本发明构建的模拟剂cv值为3.0％～7.0％，实现了高单分散性及对金黄色葡萄球菌的高一致性模拟；通过与金黄色葡萄球菌开展对比试验，证实了本发明所述模拟剂在粒径、荧光特征信号和气溶胶模拟等方面均可有效模拟金黄色葡萄球菌，可在生物气溶胶监测和防护装备的模拟测试方面得到广泛应用。
41.基于上述原理，本发明提出一种基于聚苯乙烯微球的金黄色葡萄球菌模拟剂的制备方法，包括：
42.s1、在乙醇和水溶液中加入聚乙烯吡咯烷酮、偶氮二异丁腈和苯乙烯，将配制好的乙醇溶液溶解后放入加热磁力搅拌器中，通入氮气排除系统中的氧气，打开加热磁力搅拌器进行聚合反应，得到聚苯乙烯亚微米级微球分散体，离心收集；用无水乙醇悬浮，加入氨基硅烷，搅拌后用无水乙醇洗涤，收集；
43.s2、将5g聚苯乙烯微球在50ml氯甲基甲醚中溶胀60分钟，向混合物中加入1.2wt％三氯化铝；在50℃下搅拌12小时后，通过离心收集微球，并用丙酮、盐酸溶液、无水乙醇和去离子水多次洗涤；离心收集，离心后悬浮于无水乙醇溶液中，加入氨基硅烷，室温下搅拌，用无水乙醇洗涤并收集，得到稳定的荧光微球；
44.s3、配制一定梯度质量比的甘油/水溶液，计算其密度和粘度；将制备的聚苯乙烯微球样品加入到甘油/水溶液，确定微球可在溶液中长时间悬浮时的甘油/水质量比，水溶液的密度和微球的密度相同；更换甘油/水质量比溶液，根据公式计算目标微球沉降到底部所需的时间，沉降样品，达到计算的时间后，去除上层小微球，重复数次至上层接近澄清；再次沉降样品，在计算时间前，收集上层液体微球，去除底物微球，重复数次，至底物无明显微球沉淀为止，得到目标粒径的微球；
45.所述下沉时间的计算公式包括：
46.其中，d为微球下降距离，v为微球运动速度，μ为水相的动态粘度，r为一个微球的半径，g为重力加速度，ρ
液
为水溶液密度，ρ
球
为微球密度；
47.s4、使用超滤离心管对聚苯乙烯微球进一步筛选，将s3中得到的目标粒径的微球加入超滤离心管中，经离心，用乙醇重悬上层过滤器中的微球，得到目标粒径微球；
48.s5、将单分散聚苯乙烯微球雾化，形成浓度均匀稳定的气溶胶环境，得到基于聚苯乙烯的金黄色葡萄球菌模拟剂。
49.实施例1
50.本发明提出了一种苯乙烯10wt％的模拟金黄色葡萄球菌的高单分散性聚苯乙烯荧光微球的制备和筛选方法。
51.主要包括：
52.s1、在每100ml乙醇和水溶液中加入聚乙烯吡咯烷酮3wt％、偶氮二异丁腈1wt％和苯乙烯10wt％，所述乙醇溶液中乙醇与水的体积为1：4，反应温度为70℃，将每100ml配置好的乙醇溶液溶解后放入超声波反应器中，通入氮气排除系统中的氧气，打开超声波发生器进行聚合反应，得到聚苯乙烯亚微米级微球分散体，离心收集；用5ml无水乙醇悬浮，加入5μ
l氨基硅烷，搅拌1小时，用等体积无水乙醇洗涤，收集；
53.s2、将5g聚苯乙烯微球在50ml氯甲基甲醚中溶胀60分钟，向混合物中加入1.2wt％三氯化铝；在50℃下搅拌12小时后，通过离心收集微球，并用丙酮、盐酸溶液、无水乙醇和去离子水多次洗涤并收集；离心收集，离心后悬浮于无水乙醇溶液中，加入氨基硅烷，室温下搅拌，用无水乙醇洗涤并收集，得到稳定的荧光微球；
54.s3、配制10％、25％、50％等一定梯度质量比的甘油/水溶液，计算其密度和粘度；将制备的聚苯乙烯微球样品加入到甘油/水溶液，确定微球可在溶液中长时间悬浮时的甘油/水质量比，水溶液的密度和微球的密度相同；更换甘油/水质量比溶液，根据公式计算目标微球沉降到底部所需的时间，沉降样品，达到计算的时间后，去除上层小微球，重复数次至上层接近澄清；再次沉降样品，在计算时间前，收集上层液体微球，去除底物微球，重复数次，至底物无明显微球沉淀为止，最终得到目标粒径的微球；
55.所述下沉时间的计算公式包括：
56.其中，d为微球下降距离，v为微球运动速度，μ为水相的动态粘度，r为一个微球的半径，g为重力加速度，ρ
液
为水溶液密度，ρ
球
为微球密度；
57.s4、进一步使用650nm超滤离心管对聚苯乙烯微球进一步筛选，将s3中得到的目标粒径的微球加入650nm超滤离心管中，5000rpm离心10min，用乙醇重悬上层过滤器中的微球，重复三次，得到目标粒径微球；
58.s5、将单分散聚苯乙烯微球和金黄色葡萄球菌颗粒分别雾化，形成浓度均匀稳定的气溶胶环境；将采样器置于测量室，用空气动力式粒径仪测量采样器上下游的气溶胶颗粒浓度。
59.结果：请参阅图1a和图1c，本发明中使用10wt％的苯乙烯制备的微球的粒径分别为722nm，微球的粒径分布随着苯乙烯用量的增加而变大，过低的苯乙烯浓度不能得到单分散的聚苯乙烯微球。由于在较低的苯乙烯浓度下，形成初级粒子需要较长的时间，所形成的初级粒子由于吸收单体量不足而不能长大，因此粒度分布变宽；而在较高的苯乙烯浓度下，形成的初级核较多，核与核之间相互碰撞形成较大核的概率增加，分散剂悬浮能力变差，成球过程加快，因此分布变宽。
60.实施例2
61.本发明提出了一种苯乙烯6wt％的模拟金黄色葡萄球菌的高单分散性聚苯乙烯荧光微球的制备和筛选方法。
62.主要包括：
63.s1、在每100ml乙醇和水溶液中加入聚乙烯吡咯烷酮3wt％、偶氮二异丁腈1wt％和苯乙烯6wt％，所述乙醇溶液中乙醇与水的体积为1:4，反应温度为70℃，将每100ml配置好的乙醇溶液溶解后放入超声波反应器中，通入氮气排除系统中的氧气，打开超声波发生器进行聚合反应，得到聚苯乙烯亚微米级微球分散体，离心收集；用5ml无水乙醇悬浮，加入5μl氨基硅烷，搅拌1小时，用等体积无水乙醇洗涤，收集；
64.s2、将5g聚苯乙烯微球在50ml氯甲基甲醚中溶胀60分钟，向混合物中加入1.2wt％三氯化铝；在50℃下搅拌12小时后，通过离心收集微球，并用丙酮、盐酸溶液、无水乙醇和去离子水多次洗涤并收集；离心收集，离心后悬浮于无水乙醇溶液中，加入氨基硅烷，室温下
搅拌，用无水乙醇洗涤并收集，得到稳定的荧光微球；
65.s3、配制10％、25％、50％等一定梯度质量比的甘油/水溶液，计算其密度和粘度。将制备的聚苯乙烯微球样品加入到甘油/水溶液，确定微球可在溶液中长时间悬浮时的甘油/水质量比，水溶液的密度和微球的密度相同；更换甘油/水质量比溶液，根据公式计算目标微球沉降到底部所需的时间，沉降样品，达到计算的时间后，去除上层小微球，重复数次至上层接近澄清。再次沉降样品，在计算时间前，收集上层液体微球，去除底物微球，重复数次，至底物无明显微球沉淀为止，最终得到目标粒径的微球；
66.所述下沉时间的计算公式包括：
67.其中，d为微球下降距离，v为微球运动速度，μ为水相的动态粘度，r为一个微球的半径，g为重力加速度，ρ
液
为水溶液密度，ρ
球
为微球密度。
68.结果：请参阅图1a和图1b，本发明中使用6wt％的苯乙烯制备的微球的粒径分别为560nm，微球的粒径分布随着苯乙烯用量的增加而变大，过低的苯乙烯浓度不能得到单分散的聚苯乙烯微球。由于在较低的苯乙烯浓度下，形成初级粒子需要较长的时间，所形成的初级粒子由于吸收单体量不足而不能长大，因此粒度分布变宽；而在较高的苯乙烯浓度下，形成的初级核较多，核与核之间相互碰撞形成较大核的概率增加，分散剂悬浮能力变差，成球过程加快，因此分布变宽。
69.实施例3
70.本发明提出了一种苯乙烯14wt％的模拟金黄色葡萄球菌的高单分散性聚苯乙烯荧光微球的制备和筛选方法。
71.主要包括：
72.s1、在每100ml乙醇和水溶液中加入聚乙烯吡咯烷酮3wt％、偶氮二异丁腈1wt％和苯乙烯14wt％，所述乙醇溶液中乙醇与水的体积为1：4，反应温度为70℃，将每100ml配置好的乙醇溶液溶解后放入超声波反应器中，通入氮气排除系统中的氧气，打开超声波发生器进行聚合反应，得到聚苯乙烯亚微米级微球分散体，离心收集；用5ml无水乙醇悬浮，加入5μl氨基硅烷，搅拌1小时，用等体积无水乙醇洗涤，收集。
73.s2、将5g聚苯乙烯微球在50ml氯甲基甲醚中溶胀60分钟，向混合物中加入1.2wt％三氯化铝；在50℃下搅拌12小时后，通过离心收集微球，并用丙酮、盐酸溶液、无水乙醇和去离子水多次洗涤并收集；离心收集，离心后悬浮于无水乙醇溶液中，加入氨基硅烷，室温下搅拌，用无水乙醇洗涤并收集，得到稳定的荧光微球；
74.s3、配制10％、25％、50％等一定梯度质量比的甘油/水溶液，计算其密度和粘度；将制备的聚苯乙烯微球样品加入到甘油/水溶液，确定微球可在溶液中长时间悬浮时的甘油/水质量比，水溶液的密度和微球的密度相同；更换甘油/水质量比溶液，根据公式计算目标微球沉降到底部所需的时间，沉降样品，达到计算的时间后，去除上层小微球，重复数次至上层接近澄清；再次沉降样品，在计算时间前，收集上层液体微球，去除底物微球，重复数次，至底物无明显微球沉淀为止，最终得到目标粒径的微球；
75.所述下沉时间的计算公式包括：
76.其中，d为微球下降距离，v为微球运动速度，μ为水相的动态粘度，r为一个微球的
半径，g为重力加速度，ρ
液
为水溶液密度，ρ
球
为微球密度。
77.结果：请参阅图1a和图1d，本发明中使用14wt％的苯乙烯制备的微球的粒径分别为779nm，微球的粒径分布随着苯乙烯用量的增加而变大，过低的苯乙烯浓度不能得到单分散的聚苯乙烯微球。由于在较低的苯乙烯浓度下，形成初级粒子需要较长的时间，所形成的初级粒子由于吸收单体量不足而不能长大，因此粒度分布变宽；而在较高的苯乙烯浓度下，形成的初级核较多，核与核之间相互碰撞形成较大核的概率增加，分散剂悬浮能力变差，成球过程加快，因此分布变宽。
78.实施例4
79.本发明提出了一种聚乙烯吡咯烷酮5wt％的模拟金黄色葡萄球菌的高单分散性聚苯乙烯荧光微球的制备和筛选方法。
80.主要包括：
81.s1、在每100ml乙醇和水溶液中加入聚乙烯吡咯烷酮5wt％、偶氮二异丁腈1wt％和苯乙烯10wt％，所述乙醇溶液中乙醇与水的体积为1:4，反应温度为70℃，将每100ml配置好的乙醇溶液溶解后放入超声波反应器中，通入氮气排除系统中的氧气，打开超声波发生器进行聚合反应，得到聚苯乙烯亚微米级微球分散体，离心收集；用5ml无水乙醇悬浮，加入5μl氨基硅烷，搅拌1小时，用等体积无水乙醇洗涤，收集；
82.s2、将5g聚苯乙烯微球在50ml氯甲基甲醚中溶胀60分钟，向混合物中加入1.2wt％三氯化铝；在50℃下搅拌12小时后，通过离心收集微球，并用丙酮、盐酸溶液、无水乙醇和去离子水多次洗涤并收集；离心收集，离心后悬浮于无水乙醇溶液中，加入氨基硅烷，室温下搅拌，用无水乙醇洗涤并收集，得到稳定的荧光微球；
83.s3、配制10％、25％、50％等一定梯度质量比的甘油/水溶液，计算其密度和粘度；将制备的聚苯乙烯微球样品加入到甘油/水溶液，确定微球可在溶液中长时间悬浮时的甘油/水质量比，水溶液的密度和微球的密度相同；更换甘油/水质量比溶液，根据公式计算目标微球沉降到底部所需的时间，沉降样品，达到计算的时间后，去除上层小微球，重复数次至上层接近澄清。再次沉降样品，在计算时间前，收集上层液体微球，去除底物微球，重复数次，至底物无明显微球沉淀为止，最终得到目标粒径的微球；
84.所述下沉时间的计算公式包括：
85.其中，d为微球下降距离，v为微球运动速度，μ为水相的动态粘度，r为一个微球的半径，g为重力加速度，ρ
液
为水溶液密度，ρ
球
为微球密度。
86.结果：如图2a和图2b所示，在pvp浓度较低(1wt％～5wt％)的体系中，体系粘度较小，表面张力较小，形成的原核直径较大；但体系悬浮和分散能力较弱，形成的原核碰撞和融合的几率较高。原生核并未得到有效的分散和保护，所以此时形成的原生粒子粒径分布较宽。在本发明中，选择5wt％pvp浓度进行实验。
87.实施例5
88.本发明提出了一种依据筛分方法对微球粒径分散性影响进行筛分方法选择的实验。
89.配制10％、25％、50％等一定梯度质量比的甘油/水溶液，计算其密度和粘度；将制备的聚苯乙烯微球样品加入到甘油/水溶液，确定微球可在溶液中长时间悬浮时的甘油/水
质量比，水溶液的密度和微球的密度相同；更换甘油/水质量比溶液，根据公式计算目标微球沉降到底部所需的时间，沉降样品，达到计算的时间后，去除上层小微球，重复数次至上层接近澄清；再次沉降样品，在计算时间前，收集上层液体微球，去除底物微球，重复数次，至底物无明显微球沉淀为止，最终得到目标粒径的微球；进一步使用650nm超滤离心管对聚苯乙烯微球进一步筛选，将s3中得到的目标粒径的微球加入650nm超滤离心管中，5000rpm离心10min，用乙醇重悬上层过滤器中的微球，重复三次，得到目标粒径微球。
90.所述下沉时间的计算公式包括：
91.其中，d为微球下降距离，v为微球运动速度，μ为水相的动态粘度，r为一个微球的半径，g为重力加速度，ρ
液
为水溶液密度，ρ
球
为微球密度。
92.结果：请参阅图3a，洗涤离心后的聚苯乙烯微球平均粒径752nm，cv值为17.4％；请参阅图3b，经梯度沉降法处理后聚苯乙烯微球平均粒径722nm，cv值为9.8％；请参阅图3c，经650nm超滤离心管筛选后聚苯乙烯微球平均粒径733nm，cv值为3.0％。说明经过本发明采用的分散聚合法和系列筛分技术获得了直径与金黄色葡萄球菌相似的高单分散聚苯乙烯荧光微球，本发明构建的模拟剂cv值为3.0％～7.0％，实现了高单分散性及对金黄色葡萄球菌的高一致性模拟。
93.实施例6
94.本发明提出了一种聚苯乙烯荧光微球和金黄色葡萄球菌的荧光光谱对比实验。
95.将冷冻保存的标准菌株在营养琼脂上划线复苏，37℃培养18小时～24小时，从平板上挑出单个金黄色葡萄球菌菌落，接种到营养肉汤中，37℃培养18小时-24小时，取菌液接种到baird-parker培养基上，37℃培养至菌落生长，然后随机挑出10个菌落进行革兰氏染色，在显微镜下观察，细菌呈葡萄球菌状排列，无芽胞，无荚膜，直径约为0.5微米～1.0微米，选择每毫升含有108个金黄色葡萄球菌的溶液进行后续实验，使用稳态/瞬态荧光光谱仪观察金黄色葡萄球菌和荧光聚苯乙烯微球的荧光光谱；金黄色葡萄球菌和微球的平均粒径和粒径分布由纳米粒径和zeta电位分析仪测定。
96.结果：请参阅图4，聚苯乙烯微球能在400-500nm范围内产生一个宽的荧光发射峰，最大荧光发射峰分别稳定在439nm和462nm，与金黄色葡萄球菌的最大荧光发射峰重合，可较好地模拟金黄色葡萄球菌的荧光信号。
97.实施例7
98.本发明提出了一种聚苯乙烯微球的荧光寿命实验，以验证荧光聚苯乙烯微球的稳定性。
99.用稳态/瞬态荧光光谱仪检测聚苯乙烯微球在4℃下存放180d后的荧光寿命；将溶液加入到比色皿中，放入仪器中，选择使用对应的光源，调节参数，步长1nm，积分时间0.2s测试光谱，荧光寿命选择通道1024，磷光寿命选择通道2000。
100.结果：请参阅图5，聚苯乙烯微球的荧光寿命与180d前的聚苯乙烯微球基本一致，因此，本发明制备的聚苯乙烯微球用于模拟金黄色葡萄球菌荧光信号具有良好的稳定性。
101.实施例8
102.本发明提出了一种聚苯乙烯微球模拟金黄色葡萄球菌制造气溶胶实验，同时用以验证荧光聚苯乙烯微球模拟结果的准确性。
103.以800nm粒径的聚苯乙烯荧光微球模拟金黄色葡萄球菌制造气溶胶，选择粒径接近的金黄色葡萄球菌，培养过夜，离心收集细菌，洗涤5-10次，与超纯水混合，超声处理30分钟，并通过雾化处理产生生物气溶胶，形成浓度均匀稳定的气溶胶环境；将采样器置于测量室，用空气动力式粒径仪测量采样器上下游的气溶胶颗粒浓度，并分析其粒径分布。
104.结果：请参阅图6，聚苯乙烯荧光微球和金黄色葡萄球菌的粒径基本集中在500nm-1000nm的范围内，气溶胶模拟测试粒径分布较一致，模拟结果较准确。
105.对比例
106.提出了一种本发明与市售及常规亚微米级功能微球的比对。
107.在每100ml乙醇和水溶液中加入聚乙烯吡咯烷酮3wt％、偶氮二异丁腈1wt％和苯乙烯10wt％，所述乙醇溶液中乙醇与水的体积为1：4，反应温度为70℃，将每100ml配置好的乙醇溶液溶解后放入超声波反应器中，通入氮气排除系统中的氧气，打开超声波发生器进行聚合反应，得到聚苯乙烯亚微米级微球分散体，离心收集；用5ml无水乙醇悬浮，加入5μl氨基硅烷，搅拌1小时，用等体积无水乙醇洗涤，收集；将5g聚苯乙烯微球在50ml氯甲基甲醚中溶胀60分钟，向混合物中加入1.2wt％三氯化铝；在50℃下搅拌12小时后，通过离心收集微球，并用丙酮、盐酸溶液、无水乙醇和去离子水多次洗涤并收集，得到稳定的荧光微球；通过扫描电子显微镜观察不同聚苯乙烯微球的图像，微球的平均粒径和粒径分布由激光衍射粒径分析仪测定，粒度分布由变异系数来评估，变异系数越大，粒度分布越宽。
108.结果：对于理想的单分散微球，其均匀性为零，而对于大多数市售及常规制备的单分散微球，这一数值通常在10％～20％之间，如果变异系数高于20％，则粒度分布太宽，无法实现本发明金黄色葡萄球菌模拟剂的效用。
109.需要说明的是，术语“包括”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包含这些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括...”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。
110.以上仅为本技术的实施例而已，并不用于限制本技术。对于本领域技术人员来说，本技术可以有各种更改和变化。凡在本技术的精神和原理之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本技术的权利要求范围之内。