用于治疗脊髓损伤的半三明治金属铱配合物及其制备方法

1.本发明属于生物医药技术领域，特别涉及一种用于治疗脊髓损伤的半三明治金属铱配合物及其制备方法与应用。


背景技术：

2.脊髓损伤（spinal cord injury，sci）是一种严重的中枢神经损伤，导致损伤平面下肢体运功、感觉功能障碍，严重者可导致永久性的脊髓功能障碍，严重影响患者生活质量。sci发生后功能障碍的主要原因是直接的机械损伤导致神经元受损，以及随后发生继发损伤，包括炎症反应，氧化应激反应和兴奋性损伤等，从而使神经元轴突受损以及胶质细胞增生，最终导致神经元细胞死亡。其中氧化应激（oxidative stress，os）是sci后的一个关键病理生理过程。os是指生物体内氧化和抗氧化的细胞途径之间的不平衡，导致过多的自由基积累，包括活性氧（ros）和活性氮。在生理条件下，细胞内低浓度的ros通过刺激内源性抗氧化防御机制和加强细胞修复过程，有利于维持细胞的平衡。然而，sci后ros的过度产生会压倒抗氧化防御机制，并通过损害重要的细胞成分，如脂质、蛋白质和核酸，对细胞产生致命的影响，进而在继发损伤阶段促成了一连串的炎症反应、兴奋性毒性、神经元和胶质细胞凋亡等过程。因此，抑制sci急性期发生的氧自由基的增多或清除过多的氧自由基，能有效减轻sci后发生的继发损伤。
3.金属铱配合物是由铱（iii）金属中心与配体通过配位键形成的化合物，其稳定性良好，能较容易地进入细胞内，因此在生物领域被广泛研究，主要应用于生物探针、化学免疫治疗、光动力治疗和靶向药物研究等，但目前对于具有抗氧化应激以及促进脊髓损伤修复的金属铱配合物的研究尚且不足，临床上缺乏相关具有显著疗效的药物。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于解决现有技术中所存在的技术问题，提供一种用于治疗脊髓损伤的半三明治金属铱配合物及其制备方法和应用，所述半三明治金属铱配合物能够有效降低细胞内活性氧水平，实现显著的抗氧化能力，促进脊髓损伤的修复，在脊髓损伤后抑制氧化应激具有广阔的前景。
5.为了解决上述技术问题，本发明是通过如下技术方案得以实现的。
6.本发明第一方面提供了一种半三明治金属铱配合物，其结构式如下所示：，所述半三明治金属铱配合物命名为e80。
7.作为优选地，所述半三明治金属铱配合物由如下方法制备而得：（1）将2-氰吡啶加热熔化，加入一水合肼，再加入乙醇，搅拌过夜；减压蒸发溶剂，所得固体悬浮于石油醚中，冰浴冷却，过滤，甲苯重结晶提纯，得到（吡啶-2-基）酰胺腙；（2）将步骤（1）中所得（吡啶-2-基）酰胺腙置于schlenk管中，加入碳酸钠，35
±
2℃加热5分钟，再加入二甲乙酰胺（dmaa）和四氢呋喃（thf），然后冷却到0℃，得到混合物；另取2-氟苯甲酰氯和二甲乙酰胺混合液，加入到混合物中，搅拌5小时，关闭制冷，恢复至室温；反应结束后过滤，冲洗，所得固体加入到乙二醇中，加热至190℃，反应30分钟，冷却后收集白色固体，得到2fphtz配体；（3）将[（η
5-cp
xbiph
）ircl2]2和2fphtz配体加入到二氯甲烷（ch2cl2）中，在保护气体、室温条件下搅拌16小时，加入六氟磷酸铵，减压下去除所有溶剂，得到的黄色固体用二氯甲烷（ch2cl2）饱和溶解并在其上方铺上正己烷进行结晶，即得。
[0008]
作为优选地，步骤（1）中所述2-氰吡啶、一水合肼、乙醇、石油醚的用量比为0.05mol：0.05mol：2.5ml：25ml。
[0009]
作为优选地，步骤（2）中所述（吡啶-2-基）酰胺腙、碳酸钠、二甲乙酰胺、四氢呋喃、2-氟苯甲酰氯和二甲乙酰胺混合液的用量比为7.5mmol：7.5mmol：7.5ml：2.5ml：10ml。
[0010]
作为优选地，步骤（2）中所述2-氟苯甲酰氯和二甲乙酰胺混合液中间氟苯甲酰氯和二甲乙酰胺的体积比为3:1。
[0011]
作为优选地，步骤（3）中所述[（η
5-cp
xbiph
）ircl2]2、2fphtz配体、二氯甲烷、六氟磷酸铵的用量比为0.2mmol：0.44mmol：15ml：0.88mmol。
[0012]
作为优选地，步骤（3）中所述保护气体选自氮气、氩气、氦气、二氧化碳中的一种或多种。
[0013]
本发明第二方面提供了一种半三明治金属铱配合物的制备方法，包括如下步骤：（1）将2-氰吡啶加热熔化，加入一水合肼，再加入乙醇，搅拌过夜；减压蒸发溶剂，所得固体悬浮于石油醚中，冰浴冷却，过滤，甲苯重结晶提纯，得到（吡啶-2-基）酰胺腙；（2）将步骤（1）中所得（吡啶-2-基）酰胺腙置于schlenk管中，加入碳酸钠，35
±
2℃加热5分钟，再加入二甲乙酰胺（dmaa）和四氢呋喃（thf），然后冷却到0℃，得到混合物；另取2-氟苯甲酰氯和二甲乙酰胺混合液，加入到混合物中，搅拌5小时，关闭制冷，恢复至室温；反应结束后过滤，冲洗，所得固体加入到乙二醇中，加热至190℃，反应30分钟，冷却后收集白色固体，得到2fphtz配体；（3）将[（η
5-cp
xbiph
）ircl2]2和2fphtz配体加入到二氯甲烷（ch2cl2）中，在保护气体、室温条件下搅拌16小时，加入六氟磷酸铵，减压下去除所有溶剂，得到的黄色固体用二氯甲烷（ch2cl2）饱和溶解并在其上方铺上正己烷进行结晶，即得。
[0014]
作为优选地，步骤（1）中所述2-氰吡啶、一水合肼、乙醇、石油醚的用量比为0.05mol：0.05mol：2.5ml：25ml。
[0015]
作为优选地，步骤（2）中所述（吡啶-2-基）酰胺腙、碳酸钠、二甲乙酰胺、四氢呋喃、2-氟苯甲酰氯和二甲乙酰胺混合液的用量比为7.5mmol：7.5mmol：7.5ml：2.5ml：10ml。
[0016]
作为优选地，步骤（2）中所述2-氟苯甲酰氯和二甲乙酰胺混合液中间氟苯甲酰氯和二甲乙酰胺的体积比为3:1。
[0017]
作为优选地，步骤（3）中所述[（η
5-cp
xbiph
）ircl2]2、2fphtz配体、二氯甲烷、六氟磷
酸铵的用量比为0.2mmol：0.44mmol：15ml：0.88mmol。
[0018]
作为优选地，步骤（3）中所述保护气体选自氮气、氩气、氦气、二氧化碳中的一种或多种。
[0019]
本发明第三方面提供了一种预防和/或治疗与氧化应激相关的疾病的药物组合物，包括半三明治金属铱配合物，其结构式如下所示：。
[0020]
作为优选地，所述与氧化应激相关的疾病为继发性脊髓损伤。
[0021]
本发明第四方面提供了一种半三明治金属铱配合物在制备用于预防和/或治疗与氧化应激相关的疾病的药物中的应用，所述半三明治金属铱配合物结构式如下所示：。
[0022]
作为优选地，所述与氧化应激相关的疾病为继发性脊髓损伤。
[0023]
本发明第五方面提供了一种半三明治金属铱配合物在制备用于清除氧自由基的药物中的应用，所述半三明治金属铱配合物结构式如下所示：。
[0024]
本发明相对于现有技术具有如下技术效果：本发明制备合成的半三明治金属铱配合物e80能够有效降低细胞内活性氧水平，实现显著的抗氧化能力。经e80处理后可促进分支形成和神经突生长，表明e80可修复海马神经元细胞，对抗氧化应激诱导的损伤。此外，体内研究表明，在采用e80处理后，能够显著促进脊髓损伤小鼠运动功能的恢复，且恢复速度明显高于损伤组，bms评分改善明显；同时，e80处理后的脊髓损伤小鼠体内ros生物发光强度显著降低，ros生物发光强度的定量值说明e80通过降低小鼠脊髓处的ros促进脊髓损伤的修复，进一步证实了e80在体内具有显著的氧自由基清除以及脊髓损伤修复作用。本发明为脊髓损伤药物助治疗提供一种新的研究
思路和药物来源，具有显著的临床应用前景和社会价值。
附图说明
[0025]
图1为2fphtz配体的合成工艺示意图。
[0026]
图2为2fphtz配体的1h nmr图。
[0027]
图3为e80的合成工艺示意图。
[0028]
图4为e80的1h nmr图。
[0029]
图5为e80对ht22细胞毒性检测结果示意图。
[0030]
图6为e80对海马神经元的毒性检测结果示意图。
[0031]
图7为通过流式细胞仪荧光检测ht22细胞内活性氧水平结果示意图。
[0032]
图8为定量分析e80对ht22细胞内活性氧水平影响结果示意图。
[0033]
图9为e80对神经元损伤修复功能影响研究结果示意图。
[0034]
图10为e80对神经元损伤修复功能影响定量分析结果示意图。
[0035]
图11为e80对脊髓损伤后动物的行为学功能影响研究结果示意图。
[0036]
图12为小鼠活体成像典型图。
[0037]
图13为小鼠活体成像荧光强度示意图。
具体实施方式
[0038]
为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下参照实施例对本发明作进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0039]
在无特别说明的情况下，本发明上下文中所使用的试剂中，均通过市售获得。对于动物实验，相关程序及方法符合医学伦理学要求。本发明所使用的实验方法均为本领域的常规方法和技术。
[0040]
生物学实验重复中选择具有代表性的结果呈现在上下文附图中，数据按照图示中规定的以mean
±
sd和mean
±
sem展示。所有实验至少重复三次。数据采用graphpad prism 5.0或spss 22.0软件进行分析。采用t检验、卡方检验、方差分析等常规医学统计学方法比较两组或两组以上的平均值差异。p＜0.05被认为是一个显著的差异。
[0041]
实施例1 半三明治金属铱配合物（e80）的制备及表征一种半三明治金属铱配合物的制备方法，包括如下步骤：（1）合成（吡啶-2-基）酰胺腙：将2-氰吡啶（5.2g，0.05mol）缓慢加热熔化，然后加入一水合肼（2.6ml，2.7g，0.05mol），得到混浊混合物。加入乙醇（2.5ml），搅拌过夜，形成凝胶状产物，减压蒸发溶剂，悬浮于石油醚（25ml）中，冰浴冷却，过滤，甲苯重结晶提纯，得（吡啶-2-基）酰胺腙（5.3g，77.4%）；（2）合成2fphtz配体：取（吡啶-2-基）酰胺腙（1.0g，7.5mmol），将其置于火焰干燥、氮气净化的50ml schlenk管中，加入碳酸钠（0.8g，7.5mmol），35
±
2℃加热5分钟，加入7.5ml干燥的二甲乙酰胺（dmaa）和2.5ml干燥的四氢呋喃（thf），然后冷却到0℃，得到淡黄色的悬浮液。用一个新的50ml干schlenk烧瓶，加入7.5mmol 2-氟苯甲酰氯和2.5ml dmaa，将该溶液滴加到预冷的酰胺氮酮混合物中，制得亮黄色溶液。将亮黄色溶液搅拌5小时，关
闭制冷，使之恢复到室温。反应结束后过滤得到淡黄色固体，用水和乙醇冲洗。所得固体加入到10ml乙二醇中，加热至190℃，反应30分钟，冷却后形成的白色固体即为2fphtz配体，收集，无需进一步纯化即可使用（1.3g，72.1%）。
[0042]
所述2fphtz配体的合成工艺及1h nmr图如图1-2所示，其核磁共振数据如下：1h nmr（500mhz，dmso）δ10.27（s，1h），8.60（d，j=4.4hz，1h），8.17（d，j=8.0hz，1h），7.92（t，j=7.7hz，1h），7.64（t，j=7.4hz，1h），7.56
–
7.48（m，2h），7.32（dd，j=16.0，8.4hz，2h）。
[0043]
（3）合成半三明治金属铱配合物e80：将0.2mmol的[（η
5-cp
xbiph
）ircl2]2和0.44mmol的2fphtz配体分散在15ml ch2cl2中，在氮气下室温搅拌16小时，加入0.143g（0.88mmol）六氟磷酸铵。反应完成（tlc）后，在减压下去除所有溶剂，得到的黄色固体用ch2cl2饱和溶解并在其上方铺上正己烷进行结晶，得半三明治金属铱配合物（e80）（0.166g，46.1%）。
[0044]
所述半三明治金属铱配合物e80的合成工艺及1h nmr图如图3-4所示，其核磁共振数据如下：1h nmr（500mhz，dmso）δ11.19（s，1h），8.61（dd，j=18.9，6.7hz，2h），8.38（t，j=8.4hz，1h），7.86（t，j=7.6hz，2h），7.82
–
7.61（m，6h），7.60
–
7.55（m，1h），7.50（t，j=7.6hz，2h），7.41（t，j=7.3hz，1h），7.31（t，j=8.1hz，2h），1.68（dd，j=43.7，21.8hz，12h）。
[0045]
实施例2 e80对神经元细胞的毒性研究（1）取对数期ht22细胞接种于96孔板中，置于37℃、95% o2、5% co2的培养箱中培养；（2）待细胞完全贴壁后，分别于孔中加入不同浓度（0，1.563，3.125，6.25，12.5，单位：μmol/l）的e80，继续培养12h；（3）使用cck8试剂盒（beyotime，cat#c0038）进行检测，评估培养中的ht22细胞的生存能力。
[0046]
检测结果如图5所示。结果显示，e80在浓度为3.125μmol/l及以下时，细胞存活率超过90%；在浓度为在浓度为12.5μmol/l及以下时，细胞存活率超过80%，由此可见，e80对ht22细胞无明显的细胞毒性。
[0047]
进一步地，选择大鼠海马组织进行e80毒性检测，具体步骤如下：（1）取1日龄sprague-dawley（sd）大鼠的脑海马组织，用眼科剪剪碎后加入至15ml离心管（corning）中，加入木瓜蛋白酶（sigma，cat#p4762）于37℃下消化25分钟；（2）用牛血清蛋白终止蛋白酶作用后清洗组织；（3）将分离的海马神经元以20000细胞/ml的浓度接种在96孔板（corning）中，每孔200μl，用含10%胎牛血清、10%营养混合物f-12的dmem培养基（含谷氨酰胺，gibco，carlsbad，ca，cat#12430054），置于37℃、95% o2、5% co2的培养箱中培养培养6h；（4）用含5% b-27（gibco）的neurobasal培养基替代原培养基，置于37℃、95% o2、5% co2的培养箱中培养24h；（5）细胞粘附后，分别在每孔中加入不同浓度（0，0.195，0.391，0.781，1.563，3.125，6.25，12.50，单位：μmol/l）的e80，再孵育24小时；（6）使用cck8试剂盒（beyotime，cat#c0038）进行检测，评估培养中的海马神经元的生存能力。
[0048]
结果如图6所示。结果显示，在所研究的0.195-12.50μmol/l的各浓度下，e80处理后海马神经元细胞存活率均超过80%，其生存率与空白对照组相比无显著性差异（p＞
0.05），且浓度在6.25μmol/l及以下时，海马神经元细胞存活率超过90%。由此可以明确e80安全性优异，对于海马神经元细胞无明显细胞毒性。
[0049]
实施例3 e80抗氧化能力和神经元损伤修复研究（1）取对数期ht22细胞接种于96孔板中，置于37℃、95% o2、5% co2的培养箱中培养；（2）待细胞完全贴壁后，去除原培养基，加入含120mmol/l谷氨酸的培养基，置于37℃、95% o2、5% co2的培养箱中继续培养12h，构建ht22氧化应激模型；（3）分别于孔中加入不同浓度（0.781，1.563，3.125，6.250，单位：μmol/l）的e80，继续培养12h；（4）通过活性氧检测试剂盒检测不同组别ht22细胞内活性氧，并通过流式细胞仪量化荧光。
[0050]
检测结果如图7-8所示。结果显示，e80能够显著降低ht22细胞内活性氧水平，该降低水平在一定程度上与e80的浓度呈现正相关，由此可以明确e80在细胞内具有一定的抗氧化能力。
[0051]
进一步地，选择大鼠海马组织进行e80神经元损伤修复检测，具体步骤如下：（1）取1日龄sprague-dawley（sd）大鼠脑海马组织，用眼科剪剪碎后加入至15ml离心管（corning）中，加入木瓜蛋白酶（sigma，cat#p4762）于37℃下消化25分钟；（2）用牛血清蛋白终止蛋白酶作用后清洗组织；（3）将分离的海马神经元以20000细胞/ml的浓度接种在24孔板（corning）中，每孔500μl，用含10%胎牛血清、10%营养混合物f-12的dmem培养基（含谷氨酰胺，gibco，carlsbad，ca，cat#12430054），置于37℃、95% o2、5% co2的培养箱中培养培养24h；（4）用含120μm谷氨酸的培养基替代原培养基，置于37℃、95% o2、5% co2的培养箱中培养12h形成海马神经元损伤模型；（5）细胞粘附后，分别在每孔中加入不同浓度（0.781，1.563，3.125，6.250，单位：μmol/l）的e80，继续孵育24小时，其中control组为空白对照组，海马神经元细胞未进行损伤处理；通过量化神经元突起的长度和总数来评估e80对神经元损伤修复的影响，结果如图9-10所示。结果显示，在经e80处理过的组中，神经元突起总长度明显多于损伤组。同时，我们还发现e80处理后的神经元一、二级分支长度均高于损伤组。另一方面，加入e80的神经元总突起数目明显多于损伤组。除此以外，我们还发现e80处理后的神经元二级突起数量高于损伤组，但是一级分支的数量没有明显区别。综上所述，加入e80后可明显促进损伤神经元突起的生长，表明本发明的半三明治金属铱配合物对ros诱导的神经元氧化应激损伤具有显著的保护作用。
[0052]
实施例4 e80的体内功能研究（1）选取24只6周龄雌性小鼠，分为四组，每组6只，包括空白对照组（control组，6只）、假处理对照组（sham组，只切除椎板，不损伤脊髓，6只）、模型组（injury组，6只）、e80组（injury+e80组，6只）（脊髓损伤后第二天开始腹腔注射e80 10
µ
l，浓度为6μmol/l，每日1次），构建脊髓损伤的小鼠模型的方法如下：a.剔除小鼠背部的毛发，显露小鼠背部的皮肤；
b.麻醉：用1.25%三溴乙醇以200μg/20g的剂量腹腔注射麻醉，呼吸平稳、四肢肌力明显减弱、疼痛反射与角膜反射消失表示麻醉成功；c.显露脊髓：用碘伏棉球擦拭2遍消毒皮肤；确定胸椎第9-11段（t9-t11）水平，并在t9-t11水平在背部正中作一个2.5cm长的纵向切口。钝性剥离椎旁肌，用咬骨钳去除棘突和椎板，彻底暴露t9-t11节段脊髓，使用固定器固定t10平面，切除t10椎板，操作过程中要小心避免额外的组织损伤。随后用固定器撑开固定，以充分暴露脊髓；d.将小鼠固定到路易斯维尔损伤系统装置上（louisville injury system apparatus，lisa），将脊髓调调整至冲击器下，并同时由其监测激光束确认冲击位置，以冲击深度来确定脊髓损伤程度，本实施例中设置碰撞尖端为18psi，冲击深度为1.0mm，损伤时间为0.5s；碰撞完成后将小鼠从损伤装置中取出，并从固定器中取下。给予充分止血后使用缝线缝合小鼠肌肉及皮肤。假手术组的小鼠行t10椎板切除，不行脊髓碰撞；e.关闭切口，术后皮下注射庆大霉素2000u，每日1次，连续3d，每8h进行1次人工膀胱排空直至自主排尿为止。
[0053]
所有sci小鼠的后肢运动完全丧失，并随着时间推移逐渐恢复。irfphtz治疗组小鼠明显比损伤组小鼠恢复更快。损伤后42天，irfphtz治疗组小鼠bms评分明显高于损伤组小鼠。结果表明，irfphtz处理后明显增强了小鼠sci后的行为功能恢复。
[0054]
（2）监测：从造模后开始，每3天进行一次bms评分，结果如图11所示。结果显示，开始时，除空白对照组外，所有sci小鼠的后肢运动完全丧失。随后，随着时间的推移，各组sci小鼠的后肢运动功能开始逐渐恢复，其中e80治疗组的恢复速度明显高于损伤组，bms评分逐渐改善。损伤后第42天后，e80治疗组小鼠bms评分明显高于损伤组小鼠，差异具有统计学意义。结果表明，e80处理明显增强了小鼠sci后的行为功能恢复。
[0055]
（3）小动物活体成像：损伤后第3天进行小鼠活体成像。先腹腔注射0.1ml/20g l-012（化学发光（chl）探针），l-012的浓度为4mg/ml。5分钟后，用1.25%三溴乙醇以200
µ
g/20g的剂量腹腔注射麻醉，待麻醉成功后，进行小动物活体成像。
[0056]
结果如图12-13所示。结果显示，在正常小鼠脊髓中很少见ros的生物发光，而脊髓损伤小鼠脊髓中ros的生物发光强度明显提高，并随时间增加而增加。在经过e80处理后，ros的生物发光强度显著降低，ros生物发光强度的定量值说明e80通过降低小鼠脊髓处的ros促进脊髓损伤的修复，进一步证实了e80在体内具有显著的氧自由基清除以及脊髓损伤修复作用。
[0057]
综合上述可知，本发明制备合成的半三明治金属铱配合物e80能够有效降低细胞内活性氧水平，实现显著的抗氧化能力。经e80处理后可促进分支形成和神经突生长，表明e80可修复海马神经元细胞，对抗氧化应激诱导的损伤。此外，体内研究表明，在采用e80处理后，能够显著促进脊髓损伤小鼠运动功能的恢复，且恢复速度明显高于损伤组，bms评分改善明显；同时，e80处理后的脊髓损伤小鼠体内ros生物发光强度显著降低，ros生物发光强度的定量值说明e80通过降低小鼠脊髓处的ros促进脊髓损伤的修复，进一步证实了e80在体内具有显著的氧自由基清除以及脊髓损伤修复作用。
[0058]
以上具体实施方式部分对本发明所涉及的分析方法进行了具体的介绍。应当注意的是，上述介绍仅是为了帮助本领域技术人员更好地理解本发明的方法及思路，而不是对相关内容的限制。在不脱离本发明原理的情况下，本领域技术人员还可以对本发明进行适
当的调整或修改，上述调整和修改也应当属于本发明的保护范围。