一种鼠抗草鱼IgT单克隆抗体及其制备方法和应用

本发明属于单克隆抗体，具体涉及一种鼠抗草鱼igt单克隆抗体及其制备方法和应用。

背景技术：

1、酶联免疫吸附实验(enzyme linked immunosorbent assay，elisa)是一类常用的免疫酶技术，其利用抗原与抗体互相结合的特异性反应对蛋白进行定量或定性检测，主要方法是将已知的抗原或抗体吸附在固相载体表面，然后利用酶标记的抗体或抗原与之孵育，加入显色剂显色，通过酶标仪测定待测物颜色与标准物颜色的差异，得到定性或定量的结果。通过elisa检测鱼血清和黏液中的病原特异性的抗体水平，对于鱼类传染病的预防，鱼类疫苗免疫效果的精准评价，以及鱼类疫苗使用规程的制定具有重要意义。

2、草鱼(ctenopharyngodon idella)具有肉质细嫩、个体大、肌间刺少等优点而备受消费者青睐，是我国养殖产量最大的鱼类品种。然而，随着高密度集约化养殖模式的发展，草鱼疾病频发，如败血症、出血病、肠炎病、烂鳃病和赤皮病等疾病，给我国水产养殖业造成了巨大的经济损失。由于抗生素的不断使用，细菌耐药性问题日益严峻，严重影响水产养殖业的健康可持续发展，而接种疫苗可激活鱼类免疫系统，提高机体针对特定病原的抗病力，是预防草鱼病害的重要手段，也是未来鱼类疾病防控的主流方向。但对于疫苗免疫效果的精准评价往往过程繁琐，耗时较长，且缺乏评价标准。而以鱼类免疫球蛋白(ig)的单克隆抗体为基础，通过分析被接种疫苗的鱼类的血液和黏液中的抗体(分泌到体液中的抗原特异性ig)滴度的变化规律来评价疫苗的免疫效果，将为建立草鱼疫苗免疫效果的评价标准体系提供有力的工具。

3、作为在硬骨鱼类中最新被发现的一类免疫球蛋白，igt已被证明在鱼体免疫系统中发挥着重要的免疫功能。因此对草鱼igt单克隆抗体的研制有助于深入了解草鱼体液免疫应答规律，并能帮助建立草鱼抗体分析与检测方法，继而建立以草鱼抗体水平为基础评价疫苗免疫效果的方法并制定疫苗的使用规程，推动以疫苗接种为核心的草鱼传染病的免疫防控技术的发展。另外，值得一提的是，草鱼有3种igt的亚型(分别命名为igt、igmt1和igmt2)，制备仅识别某个igt亚型的单克隆抗体十分困难，目前在所有鱼类中还没有报道研制出可特异性识别某个igt亚型的单克隆抗体。

技术实现思路

1、针对现有技术中草鱼igt单克隆抗体缺失的问题，本发明提供了一种鼠抗草鱼igt单克隆抗体和分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株，所述鼠抗草鱼igt单克隆抗体可特异性地识别草鱼igt，而不与草鱼的其他免疫球蛋白(igm、igmt1、igmt2)发生反应。

2、为了实现上述目的，本发明的技术方案具体为：

3、本发明的第一方面提供了一种鼠抗草鱼igt单克隆抗体，该抗体包含重链可变区和轻链可变区；

4、重链可变区的cdr区包含以下三个序列：

5、nyrmh(cdrh1，seq id no.3)，

6、vitvksdnyraryaesvkg(cdrh2，seq id no.4)，

7、egpyygnwvamdy(cdrh3，seq id no.5)；

8、轻链可变区的cdr区包含以下三个序列：

9、rasqsisnylh(cdrl1，seq id no.6)，

10、yasqsis(cdrl2，seq id no.7)，

11、qqshswpyt(cdrl3，seq id no.8)。

12、优选地，在上述鼠抗草鱼igt单克隆抗体中，重链可变区的氨基酸序列为：

13、qvqlvetggglvrpgnslklscvtsgftfsnyrmhwlrqppgkrlewiavitvksdnyraryaesvkgrftisrddskssvylqmnrlreedtatyfcsregpyygnwvamdywgqgtsvtvss(seq id no.1)；

14、轻链可变区的氨基酸序列为：

15、dvvltqspatlsvtpgdrvslscrasqsisnylhwyqqkshesprllikyasqsisgipsrfsgsgsgtgftlsinsvetedfgmyfcqqshswpytfgggtkleik(seq id no.2)。

16、本发明第二方面提供了上述鼠抗草鱼igt单克隆抗体的制备方法，具体为：上述鼠抗草鱼igt单克隆抗体由保藏于中国典型培养物保藏中心的杂交瘤细胞株igt-6h6g11(保藏编号cctcc no：c202288)或其传代细胞株分泌产生。

17、优选地，鼠抗草鱼igt单克隆抗体的制备过程为：取杂交瘤细胞株igt-6h6g11的培养上清液和/或将杂交瘤细胞株igt-6h6g11注射于小鼠体内后取小鼠腹水，经分离纯化后得到。

18、本发明第三方面提供了一株杂交瘤细胞株igt-6h6g11，该杂交瘤细胞株igt-6h6g11是采用大肠杆菌重组表达草鱼igt重链恒定区ch1-ch2结构域蛋白作为抗原免疫小鼠得到的，并已于2022年9月20日保藏于位于中国武汉市武汉大学的中国典型培养物保藏中心，且保藏编号为cctcc no：c202288。

19、本发明第四方面提供了编码上述鼠抗草鱼igt单克隆抗体的核酸分子。

20、优选地，上述核酸分子包括编码鼠抗草鱼igt单克隆抗体的重链可变区的核酸分子a和编码鼠抗草鱼igt单克隆抗体的轻链可变区的核酸分子b。

21、更加优选地，当重链可变区的氨基酸序列如seq id no.1所示时，核酸分子a的核苷酸序列可以为：

22、caggtgcagcttgtagagaccgggggaggcttggtgaggcctggaaattctctgaaactctcctgtgttacctcgggattcactttcagtaactaccggatgcactggcttcgccagcctccagggaagaggctggagtggattgctgtaattacagtcaagtctgataattatagagcaagatatgcagagtctgtgaaaggcagattcactatttcaagagatgattcaaaaagcagtgtctacctgcagatgaacagattaagagaggaagacactgccacttatttttgtagtagagaggggccctactatggtaactgggtggctatggactactggggtcaaggaacctcagtcaccgtctcctca(seq id no.9)；

23、当轻链可变区的氨基酸序列如seq id no.2所示时，核酸分子b的核苷酸序列可以为：

24、gatgttgtgctaactcagtctccagccaccctgtctgtgactccaggagatagagtcagtctttcctgcagggccagtcaaagtattagcaactacctacactggtatcagcaaaaatcacatgagtctccaaggcttctcatcaagtatgcttcccagtccatctctgggatcccctccaggttcagtggcagtggatcagggacaggtttcactctcagtatcaacagtgtggagactgaagattttggaatgtatttctgtcaacagagtcacagctggccttacacgttcggaggggggaccaagctggaaataaaa(seq id no.10)。

25、本发明第五方面提供了包含上述核酸分子的表达盒、重组载体或转基因细胞系。

26、本发明第六方面提供了上述鼠抗草鱼igt单克隆抗体、杂交瘤细胞株igt-6h6g11、核酸分子、表达盒、重组载体或转基因细胞系在制备草鱼igt检测试剂中的应用。

27、优选地，所述检测试剂为elisa检测试剂。

28、现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明采用大肠杆菌重组表达草鱼igt重链恒定区ch1-ch2结构域蛋白作为抗原免疫小鼠并筛选得到了一株可特异性分泌鼠抗草鱼igt单克隆抗体的杂交瘤细胞株igt-6h6g11，弥补了现有技术中草鱼igt单克隆抗体缺失的问题。而且，杂交瘤细胞株igt-6h6g11分泌产生的单克隆抗体可特异性地识别草鱼igt，不与草鱼igt另外两个亚型igmt1和igmt2反应，并且效价高，因此可用于特异性检测草鱼igt，识别特异性高、反应灵敏。