一种检测逆转录酶活性的试剂盒及检测方法与流程

本发明属于rna逆转录酶，涉及一种检测逆转录酶活性的试剂盒及检测方法。

背景技术：

1、逆转录酶是所有反转录病毒都会表达的一种酶，该酶在反转录病毒整个生命周期中都扮演着重要角色。逆转录酶通常具有dna或rna依赖的dna聚合酶活性和rnase h活性，进而可以根据反转录病毒的单链rna基因组序列合成相对应的双链dna序列，随后通过逆转录整合酶将该dna序列整合到宿主细胞基因组上。整合的dna遇合适的条件被激活后，利用宿主自身酶系统转录生成相应的rna，其中一部分作为病毒的遗传物质，另一部分作为mrna翻译成病毒所需的蛋白质。最后，rna和蛋白质则可以组装成新的病毒粒子，实现病毒的繁衍。在一定的条件下，整合的dna也可以使细胞转化成癌细胞。逆转录酶的研究对致病病毒的研究具有非常重要的意义。目前检测逆转录酶活性的试剂盒及检测方法通常采用同位素法，但此方法存在容易产生放射性污染，对检测设备要求高，操作成本高，难以实现高通量等问题。

2、cn114410736a公开了一种m-mlv逆转录酶的酶活测定组合物及测定方法，利用荧光染料结合dna发出荧光的原理(sybr染料结合cdna双链发出荧光，oligreen染料与单链结合发出荧光)，采用荧光定量的方法在37～42℃条件下等温延伸反应。但此方法存在耗材多、成本高等问题。

3、综上所述，现有检测逆转录酶活性的试剂盒及检测方法存在容易产生放射性污染，对检测设备要求高，操作成本高，难以实现高通量等问题。如何提供一种操作简单快速、成本低，且具备高灵敏度和准确性，能用于高通量筛选的检测逆转录酶活性的试剂盒及检测方法，已成为目前rna逆转录酶技术领域亟待解决的问题之一。

技术实现思路

1、针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供一种检测逆转录酶活性的试剂盒及检测方法，本发明解决了现有检测逆转录酶活性的试剂盒及检测方法存在容易产生放射性污染，操作成本高，难以实现高通量检测等问题，实现了方便简单、快速、高灵敏度和准确性地测定逆转录酶活性，能够用于高通量筛选，有利于广泛推广应用。

2、为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：

3、第一方面，本发明提供一种检测逆转录酶活性的试剂盒，所述试剂盒包括具有poly(a)尾的rna、dntps和oligo dt。

4、本发明创造性地设计了一种包括带poly(a)尾的模板rna、dntps和oligo dt的检测逆转录酶活性的试剂盒，带poly(a)尾的模板rna在逆转录酶作用下，逆转录生成大量cdna，并伴随着大量焦磷酸的产生，在一定范围内逆转录酶的活性与反应体系中焦磷酸的量成正比，通过检测反应体系中焦磷酸的量能够检测逆转录酶的活性，检测原理示意图如图1所示，实现了方便简单、快速、高灵敏度和准确性地测定逆转录酶活性，能够用于高通量筛选，有利于广泛推广应用。

5、优选地，所述具有poly(a)尾的rna的长度为100～1500nt，包括但不限于100nt、101nt、150nt、200nt、500nt、700nt、800nt、1000nt、1200nt、1400nt、1450nt或1500nt。

6、优选地，所述具有poly(a)尾的rna的核酸序列包括seq id no.1、seq id no.2或seq id no.3所示的序列。

7、seq id no.1：

8、ctcacagtggctgacatccgcaaacagagtgagcccttcttcaaggccaccccagaggagaagctcaagctggaggacttctttgcccgcaactcctatgtggctggccagtacgatgatgcagcctcctaccagcgcctcaacagccacatgaatgccctccacaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa。

9、seq id no.2：

10、cggttttacgggcgcacgtagctcaggcctcaagaccttgggctgggactggctgagcctggcgggaggcggggtccgagtcaccgcctgccgccgcgcccccggtttctataaattgagcccgcagcctcccgcttcgctctctgctcctcctgttcgacagtcagccgcatcttcttttgcgtcgccaggtgaagacgggcggagagaaacccgggaggctagggacggcctgaaggcggcaggggcgggcgcaggccggatgtgttcgcgccgctgcggggtgggcccgggcggcctccgcattgcaggggcgggcggaggacgtgatgcggcgcgggctgggcatggaggcctggtgggggaggggaggggaggcgtgtgtgtcggccggggccactaggcgctcactgttctctccctccgcgcagccgagccacatcgctcagacaccatggggaaggtgaaggtcggagtcaacgggtgagttcgcgggtggaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa。

11、seq id no.3：

12、gctcggctggcgacgcaaaagaagatgcggctgactgtcgagccacatcgctcagacaccatggggaaggtgaaggtcggagtcaacggatttggtcgtattgggcgcctggtcaccagggctgcttttaactctggtaaagtggatattgttgccatcaatgaccccttcattgacctcaactacatggtttacatgttccaatatgattccacccatggcaaattccatggcaccgtcaaggctgagaacgggaagcttgtcatcaatggaaatcccatcaccatcttccaggagcgagatccctccaaaatcaagtggggcgatgctggcgctgagtacgtcgtggagtccactggcgtcttcaccaccatggagaaggctggggctcatttgcaggggggagccaaaagggtcatcatctctgccccctctgctgatgcccccatgttcgtcatgggtgtgaaccatgagaagtatgacaacagcctcaagatcatcagcaatgcctcctgcaccaccaactgcttagcacccctggccaaggtcatccatgacaactttggtatcgtggaaggactcatgaccacagtccatgccatcactgccacccagaagactgtggatggcccctccgggaaactgtggcgtgatggccgcggggctctccagaacatcatccctgcctctactggcgctgccaaggctgtgggcaaggtcatccctgagctagacgggaagctcactggcatggccttccgtgtccccactgccaacgtgtcagtggtggacctgacctgccgtctagaaaaacctgccaaatatgatgacatcaagaaggtggtgaagcaggcgtcggagggccccctcaaaggcatcctgggctacactgagcaccaggtggtctcctctgacttcaacagcgacacccactcctccacctttgacgctggggctggcattgccctcaacgaccactttgtcaagctcatttcctggtatgacaacgaatttggctacagcaacagggtggtggacctcatggcccacatggcctccaaggagtaagacccctggaccaccagccccagcaagagcacaagaggaagagagagaccctcactgctggggagtccctgccacactcagacccccaccacactgaatctcccctcctcacagttgccatgtagaccccttgaagaggggaggggcctatgggagccgcaccttgtcatgtatccatctaataaagtatccctgtgctcaaccaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa。

13、可以理解，本发明试剂盒能够对任意具有逆转录活性的逆转录酶进行检测，所述逆转录酶可选自amv、m-mlv、amv活性突变体或m-mlv活性突变体中任意一种或至少两种的组合，更优选m-mlv逆转录酶和/或其突变体。

14、第二方面，本发明提供一种根据第一方面所述的检测逆转录酶活性的试剂盒在检测逆转录酶活性中的应用。

15、第三方面，本发明提供一种逆转录酶活性的检测方法，所述方法包括：将待测逆转录酶与第一方面所述的检测逆转录酶活性的试剂盒中的具有poly(a)尾的rna、dntps和oligo dt混合，进行逆转录反应，检测反应产物中焦磷酸的含量，将所述焦磷酸的含量带入由逆转录酶标准品建立的标准曲线中，得到所述待测逆转录酶的活性。

16、优选地，所述逆转录反应的温度为37～60℃，包括但不限于37℃、39℃、40℃、42℃、45℃、48℃、50℃、52℃、55℃，56℃、57℃或60℃；时间为5～60min，包括但不限于5min、7min、8min、9min、10min、12min、15min、20min、30min、35min、40min、50min、56min、58min或60min。

17、优选地，所述混合前还包括将具有poly(a)尾的rna和oligo dt进行退火反应的步骤。

18、优选地，所述退火反应的温度为50～70℃，包括但不限于50℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、58℃、60℃、62℃、65℃、67℃或70℃；时间为2～15min，包括但不限于2min、4min、8min、10min、12min、13min、14min或15min。

19、优选地，所述逆转录反应后还包括终止反应。

20、优选地，所述终止反应的温度为70～90℃，包括但不限于70℃、72℃、73℃、74℃、75℃、80℃、82℃、85℃、88℃或90℃；时间为5～15min，包括但不限于5min、7min、8min、9min、10min、11min、12min、13min或15min。

21、优选地，所述标准曲线的建立方法包括：

22、将逆转录酶标准品进行梯度稀释，获得梯度酶活性的逆转录酶标准品，分别利用所述梯度酶活性的逆转录酶标准品与第一方面所述的检测逆转录酶活性的试剂盒中的具有poly(a)尾的rna、dntps和oligo dt混合，进行逆转录反应，检测反应产物中焦磷酸的含量，获取每一个酶活性的逆转录酶标准品对应的焦磷酸的含量，根据所述焦磷酸的含量与酶活性的对应关系建立所述标准曲线。

23、优选地，所述焦磷酸的含量的检测方法包括荧光法。

24、优选地，所述焦磷酸的含量以荧光强度表示。

25、优选地，所述荧光法包括使用焦磷酸检测试剂盒进行检测。

26、优选地，所述荧光法采用的荧光定量试剂包括ppi sensor。

27、作为优选的技术方案，所述逆转录酶活性的检测方法包括：

28、将第一方面所述的检测逆转录酶活性的试剂盒中的具有poly(a)尾的rna和oligodt混合，进行退火反应；

29、将逆转录酶标准品进行梯度稀释，获得梯度酶活性的逆转录酶标准品，分别利用所述梯度酶活性的逆转录酶标准品与所述退火反应的产物和dntps混合，进行逆转录反应，并进行终止反应，通过荧光法检测反应产物中焦磷酸的含量，获取每一个酶活性的逆转录酶标准品对应的焦磷酸的含量，根据所述焦磷酸的含量与酶活性的对应关系建立标准曲线；

30、将待测逆转录酶与所述退火反应的产物和dntps混合，于37～60℃(包括但不限于37℃、39℃、40℃、42℃、45℃、48℃、50℃、52℃、55℃，56℃、57℃或60℃)进行逆转录反应5～60min(包括但不限于5min、7min、8min、9min、10min、12min、15min、20min、30min、35min、40min、50min、56min、58min或60min)，并于70～90℃(包括但不限于70℃、72℃、73℃、74℃、75℃、80℃、82℃、85℃、88℃或90℃)终止反应5～15min(包括但不限于5min、7min、8min、9min、10min、11min、12min、13min或15min)，通过荧光法检测反应产物中焦磷酸的含量，将所述焦磷酸的含量带入所述标准曲线中，得到所述待测逆转录酶的活性。

31、与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

32、本发明创造性地设计了一种包括带poly(a)尾的模板rna、dntps和oligo dt的检测逆转录酶活性的试剂盒，带poly(a)尾的模板rna在逆转录酶作用下，逆转录生成大量cdna，并伴随着大量焦磷酸的产生，在一定范围内逆转录酶的活性与反应体系中焦磷酸的量成正比，通过检测反应体系中焦磷酸的量能够检测逆转录酶的活性，实现了方便简单、快速、高灵敏度和准确性地测定逆转录酶活性，能够用于高通量筛选，有利于广泛推广应用。