羰基还原酶和葡萄糖脱氢酶的融合酶、编码基因、工程菌及应用

(一)本发明涉及一种羰基还原酶和葡萄糖脱氢酶的融合酶、编码基因、工程菌及应用。

背景技术：

0、(二)背景技术

1、(s)-1-(3-(三氟甲基)苯基)乙醇，cas号96789-80-9，密度1.234g/cm3，分子量190.162，易溶于有机溶剂如乙酸乙酯，微溶于水，具有特殊的生物活性，是合成手性药物(s)-ma20565的重要手性中间体。(s)-ma20565最先由三菱化学集团报道，因其带有n-甲基甲氧基亚氨基乙酰胺作为药效团和取代的醛肟醚侧链，显示出对多种病害菌的有效杀菌活性，为广谱农业杀菌剂。(s)-ma20565重要商用应用价值促使我们对其手性中间体(s)-1-(3-(三氟甲基)苯基)乙醇进行研究。

2、目前，(s)-1-(3-(三氟甲基)苯基)乙醇的合成多以化学方式为主，以潜手性酮为原料，使用昂贵的稀有金属钌络合物为催化剂制备。

技术实现思路

0、(三)
技术实现要素：

1、本发明目的是提供一种羰基还原酶和葡萄糖脱氢酶的融合酶、编码基因、工程菌及应用，通过连接肽使羰基还原酶(sred)与葡萄糖脱氢酶(gdh)融合表达，作为生物催化剂用于不对称还原手性酮制备手性醇，在不影响羰基还原酶的高催化活性和高光学选择性的基础上，降低了反应所需成本，解决了反应中辅酶消耗问题，建立了一条反应条件温和、绿色环保、光学选择性高的生物合成路线，提高了原子经济性。

2、本发明采用的技术方案是：

3、本发明提供一种羰基还原酶和葡萄糖脱氢酶的融合酶，所述融合酶氨基酸序列如seq id no.3所示。

4、本发明所述融合酶是将羰基还原酶sred和葡萄糖脱氢酶gdh通过连接肽融合而成，所述羰基还原酶氨基酸序列如seq id no:1所示，所述葡萄糖脱氢酶的氨基酸序列如seq id no:2所示，所述连接肽的氨基酸序列如seq id no:6所示。

5、所述融合酶按如下方法构建：将来源于近平滑假丝酵母菌(candidaparapsilosis)atcc 7330的基因组经pcr扩增获得带有连接肽的羰基还原酶sred编码基因片段；再将来源于枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)的葡萄糖脱氢酶gdh的基因经pcr扩增获得带有连接肽的葡萄糖脱氢酶gdh编码基因片段；以无缝克隆技术融合连接带有连接肽的羰基还原酶sred编码基因片段和带有连接肽的葡萄糖脱氢酶gdh编码基因片段至线性化载体pet-duet1，导入e.coli dh5α感受态细胞中，挑选单菌落测序验证成功后将质粒导入表达宿主细胞e.coli bl21(de3)构建重组菌，诱导重组菌产酶，经超声破碎处理后，离心后弃去沉淀得到粗酶液，经镍柱纯化得到融合酶纯酶。

6、本发明还提供一种所述羰基还原酶和葡萄糖脱氢酶的融合酶的编码基因，所述编码基因核苷酸序列如seq id no.4所示。

7、本发明还涉及含所述羰基还原酶和葡萄糖脱氢酶的融合酶的编码基因的重组载体，由重组载体构建获得的重组菌；所述重组载体以pet-duet1为基础载体，所述重组菌以e.coli bl21(de3)为宿主菌。

8、本发明还提供一种所述羰基还原酶和葡萄糖脱氢酶的融合酶在不对称还原手性酮制备手性醇中的应用，所述的应用为：以含羰基还原酶和葡萄糖脱氢酶的融合酶编码基因的重组基因工程菌发酵培养获得的湿菌体超声破碎提取的纯酶为催化剂，以手性酮为底物，加入助溶剂、葡萄糖和辅助因子nadp+，以ph5.5-7.5(优选ph6.0)缓冲液为反应介质构建反应体系，在25-45℃、100-200rpm(优选30℃、180rpm)条件下震荡反应6-36h(优选18h)，反应液分离纯化，获得手性醇；所述底物包括间三氟甲基苯乙酮、3-氟苯乙酮、2-羟基-1-苯基乙酮、间硝基苯乙酮、2-溴-4-氟苯乙酮；所述助溶剂包括乙醇、甲醇、异丙醇、甘油，优选异丙醇。

9、优选的，所述反应体系中，催化剂以纯酶质量计为1-20g/l，优选10g/l；底物加入终浓度为10-50mm，优选20mm；助溶剂体积加入终浓度为5-20％，优选10％；葡萄糖加入终浓度为20-60g/l，优选40g/l；nadp+加入终浓度为0.01-1.0mm，优选0.1mm。

10、优选的，所述催化剂按如下方法制备：

11、(1)将含羰基还原酶和葡萄糖脱氢酶的融合酶编码基因的重组基因工程菌(优选e.coli bl21(de3)-pet-duet1-sred-linker-gdh)接种于含50μg/ml卡那霉素的lb固体平板上，37℃，16h倒置培养，挑选平板上单菌落接种于含50μg/ml卡那霉素的lb液体培养基，37℃、180rpm培养16h后，将种子液以体积浓度3％的接种量接种于lb液体培养基中，37℃，180rpm培养至od600到0.6-0.8后，加入终浓度0.1-1.0mm(优选0.1mm)的iptg，23℃、180rpm诱导16h，4℃离心(8000rpm，10min)发酵液，生理盐水洗涤两次，收集菌体沉淀；

12、(2)将步骤(1)菌体沉淀加入100mm，ph 6.0磷酸缓冲液重悬菌体，超声破碎15分钟(功率120w，工作3秒，暂停5秒)，破碎液离心(8000rpm，4℃离心10min)后，取上清液，即得到融合酶粗酶液；

13、(3)用0.45μm滤膜将步骤(2)粗酶液过滤，去除漂浮沉淀，超滤(优选10kda超滤管，3000g离心1h)浓缩至超滤前体积的20-30％(优选25％)，将超滤后的融合酶粗酶液与his标签蛋白纯化层析介质(按说明书使用非变性洗涤液预处理)按体积比8:1混匀(优选在40rpm，4℃水平摇床中缓慢摇动1h)，然后上样到beyogoldtm his-tag层析柱(购自碧云天)，先用非变性洗涤液洗柱5次去除杂蛋白，每次洗脱使用1-2个柱体积；然后用非变性洗脱液洗脱6-10次(优选9次)，每次洗脱使用1-2个柱体积，通过蛋白电泳验证，收集所有含有目标蛋白的洗脱液；将洗脱液超滤浓缩后(优选10kda超滤管，3000g离心20min)，冻干(优选-53℃，冻干36h)，获得融合酶的纯酶；非变性洗涤液是含300mm nacl和2mm咪唑的ph8.0、50mm磷酸钠缓冲液；非变性洗脱液是含300mm nacl和50mm咪唑的ph8.0、50mm磷酸钠缓冲液。

14、本发明构建了含羰基还原酶(sred)和葡萄糖脱氢酶(gdh)基因的重组大肠杆菌，实现了(s)-1-(3-(三氟甲基)苯基)乙醇等手性醇的生物催化合成，同时通过融合表达葡萄糖脱氢酶，实现了辅酶nadph的再生。在整个不对称还原反应过程中，一方面羰基还原酶sred催化底物酮生成手性醇，并消耗还原性辅酶nadph，另一方面，葡萄糖脱氢酶将葡萄糖氧化为葡萄糖酸，同时消耗氧化型辅酶nadp+，生成还原型辅酶nadph，形成辅因子的再生循环系统，不断推进主反应的进行。

15、与现有技术相比，本发明的有益效果为：

16、本发明在不影响羰基还原酶的高催化活性和高光学选择性的基础上，实现了羰基还原酶(sred)和葡萄糖脱氢酶(gdh)的融合表达，融合酶活性为羰基还原酶催化活性的85％，较大程度上保证了羰基还原酶的活性。本发明节约了发酵成本，降低了发酵废液的产生量，对环境友好。融合表达不影响羰基还原酶的光学选择性，大幅降低了反应中所使用的辅酶因子，节约了反应成本。该羰基还原酶有广泛的底物谱和良好的立体选择性，用本发明方法制备所得的含羰基还原酶sred和葡萄糖脱氢酶gdh的重组酶具有对环境友好、操作简单、反应条件温和等优点，具有良好的工业应用前景。