与11型HPV结合的抗体或其抗原结合片段及其应用的制作方法

与11型hpv结合的抗体或其抗原结合片段及其应用
技术领域
1.本发明涉及抗体技术领域，尤其是涉及一种与11型hpv结合的抗体或其抗原结合片段及其应用。


背景技术：

2.人乳头状瘤病毒(human papillomavirus，hpv)是一种无包膜的小dna病毒，目前约有200多种，hpv主要感染皮肤和粘膜组织，其中有40多种hpv感染可以导致人类疾病，根据hpv感染与癌症发生的关系，hpv可以分为高危型和低危型，其中hpv 16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58及59等为高危型，高危型hpv持续性感染可引发宫颈癌、肛门癌和阴道癌等恶性肿瘤。世界范围内，宫颈癌在女性高发恶性肿瘤中排名第三，全球每年约有60万女性新发宫颈癌，超过30万的女性死于宫颈癌。其他的hpv亚型都属于低危型，主要引起皮肤黏膜的疣状增生，表现为尖锐湿疣、扁平疣等良性病变，目前在临床上还没有很好的治疗方法。流行病学调查及临床研究表明，生殖器尖锐湿疣组织中以hpv 6和hpv 11型检出率最高，统计显示hpv 6和hpv 11感染引起生殖器疣与复发性呼吸道乳头瘤病的比率超过90％。
3.预防hpv感染最有效的方法是接种hpv疫苗，目前国内外已上市的5个宫颈癌疫苗均以hpv主要衣壳蛋白l1为有效抗原，通过基因重组技术在一定条件下组装为病毒样颗粒(virus-like particles，vlps)，再辅以不同的佐剂配制成疫苗。基于重组hpv l1 vlps疫苗的成功上市及广泛应用，充分表明了l1 vlps高度还原了天然hpv的结构，保留了天然病毒的关键中和表位，具有与野生同型病毒相同或相似的抗原性和免疫原性，可诱导高滴度的中和抗体，进而很好地预防hpv持续感染、宫颈癌及其他相关疾病。目前已上市的hpv疫苗，merck公司的四价疫苗“gardasil”和九价疫苗“gardasil 9”以及国内外研制的超过二价次的hpv疫苗多数包含hpv 6型的疫苗成分。
4.在hpv疫苗生产的全程，保持正确的中和表位和稳定的vlps结构，是保证疫苗质量和有效性的前提。在疫苗生产工艺的各个环节建立准确、灵敏、特异的检测方法对抗原结构和定量进行全程监控既是技术的需要，也是法规的指导原则。利用经典的抗原抗体反应原理，采用中和抗体对抗原中和表位进行鉴定是疫苗质控的有效手段，通过western-blot、elisa和ivrp等检测方法对hpv疫苗原液、半成品及成品中的抗原成分进行鉴别实验、抗原含量检测、抗原体外效力测定，可为疫苗的检测放行提供依据。因此单克隆中和抗体作为是疫苗抗原质控的重要反应试剂，并且同时具有特异性和中和活性的单克隆抗体在疫苗质控过程中具有不可替代的作用。另外，疫苗效力检测是疫苗成品放行的重要指标，目前hpv疫苗效力是通过疫苗免疫动物后采集血清，采用假病毒中和实验来检测血清的中和效价来进行评价，虽然该方法能够较好地反映疫苗成品的中和抗体水平，但也同时存在着动物用量较多，检测值波动较大，检测周期长，成本较高的缺点，同时也违背动物实验的“3r”(减少、替代和优化)原则，国内外一些企业已在响应国际组织的倡导，在逐渐淘汰动物实验检测疫苗成品效力的方法。目前已被认同和用于部分实践的，基于中和抗体针对疫苗抗原的中和表位和体外活性的质控和表征，已经是一种高效、经济和可行的替代方法，例如美国默克公
司的hpv疫苗、国内的甲肝和乙肝疫苗，都已经部分或全部使用中和抗体而非动物实验放行疫苗产品。
5.目前关于hpv11型中和活性单克隆抗体相对于其他高危型别hpv抗体研究报道较少，国外已有质量可靠的抗体，但是由于自主知识权利的限制，国内厂商很难获得和大量制备，这对于开发国产多价hpv疫苗带来较大壁垒，因此开发出hpv11型中和活性单克隆抗体用于hpv疫苗开发和生产具有重要意义。
6.有鉴于此，特提出本发明。


技术实现要素：

7.本发明的第一目的在于提供一种与11型hpv结合的抗体或其抗原结合片段，所述与11型hpv结合的抗体或其抗原结合片段只与hpv11型抗原特异反应，具有良好的特异性和中和活性，缓解了现有技术中缺乏hpv11型中和活性抗体或其抗原结合片段的问题。
8.本发明的第二目的在于提供一种能够编码或产生上述种与11型hpv结合的抗体或其抗原结合片段的生物材料或杂交瘤细胞株。
9.本发明的第三目的在于提供一种上述与11型hpv结合的抗体或其抗原结合片段、上述生物材料或上述杂交瘤细胞株的应用。
10.为解决上述技术问题，本发明特采用如下技术方案：
11.根据本发明的一个方面，本发明提供了一种与11型hpv结合的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，包含轻链可变区和/或重链可变区；
12.所述轻链可变区具有由cdr-l1、cdr-l2、cdr-l3组成的轻链cdr，所述cdr-l1、cdr-l2、cdr-l3的氨基酸序列分别如seq id no:1、2和3所示，或者分别如seq id no:11、12和13所示；
13.所述重链可变区具有由cdr-h1、cdr-h2、cdr-h3组成的重链cdr，所述cdr-h1、cdr-h2、cdr-h3的氨基酸序列分别如seq id no:4、5和6所示，或者分别如seq id no:14、15和16所示。
14.根据本发明的另一个方面，本发明还提供了一种生物材料，所述生物材料包括核酸片段、载体或宿主细胞；
15.所述核酸片段选自(a1)或(a2)：
16.(a1)、dna或rna，其编码上述与11型hpv结合的抗体或其抗原结合片段；
17.(a2)、与(a1)中定义的核酸片段互补的核酸片段；
18.所述载体包括所述核酸片段；
19.所述宿主细胞被所述载体转化。
20.根据本发明的另一个方面，本发明还提供了杂交瘤细胞株，所述杂交瘤细胞株为杂交瘤细胞株1f9或杂交瘤细胞株1b5；
21.所述杂交瘤细胞株1f9的保藏编号为：cgmcc no.45155；
22.所述杂交瘤细胞株1b5的保藏编号为：cgmcc no.45156。
23.根据本发明的另一个方面，本发明还提供了一种用于检测11型hpv l1抗原的试剂或试剂盒，所述试剂或试剂盒包含所述的与11型hpv结合的抗体或其抗原结合片段。
24.根据本发明的另一个方面，本发明还提供了所述的与11型hpv结合的抗体或其抗
原结合片段，所述的生物材料，所述的杂交瘤细胞株或用于检测11型hpv的试剂或试剂盒在如下(x1)～(x4)中的应用：
25.(x1)疫苗质控；
26.(x2)制备用于疫苗质控的产品；
27.(x3)制备用于临床病原学检测的产品；
28.(x4)制备用于流行病调查的产品。
29.与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
30.本发明通过杂交瘤技术筛选获得针对11型hpv的鼠源单克隆抗体，该抗体对hpv11 l1 vlps和假病毒具有高度的特异性和中和活性，表明该抗体是针对hpv11 l1蛋白中和表位的抗体。对筛选获得的抗体进行基因进行测序，并对其cdr区进行分析，获得了氨基酸序列如seq id no:1、2和3所示，或者分别如seq id no:11、12和13所示的轻链cdr；以及氨基酸序列分别如seq id no:4、5和6所示，或者分别如seq id no:14、15和16所示的重链cdr。
31.采用适合的中和抗体对疫苗抗原的中和表位进行鉴别和表征是疫苗行业质控和放行的重要内容，这就要求该抗体具有良好的特异性和中和活性。为了充分证明所获的hpv11 l1抗体或其抗原结合片段的特异性，首先采用elisa法进行hpv 6、hpv11、hpv 16、hpv 18、hpv 31、hpv 33、hpv45、hpv 52、hpv 58的vlp抗原的交叉反应验证，表明拥有本发明cdr序列的抗体只与hpv11型抗原特异反应，表明其优异的特异性。为了验证该抗体的中和活性，采用假病毒中和实验，结果显示杂交瘤细胞上清的中和活性效价高达5120。
32.基于本发明筛选得到的cdr序列而衍生的与11型hpv结合的抗体或其抗原结合片段具有良好的特异性、灵敏度、线性和准确度，可以特异性快速鉴别并定量hpv11 l1蛋白，对疫苗有效抗原成分的含量及活性进行评价，广泛应用于hpv疫苗的生产质控、临床病原学检测及流行病调查，对hpv疫苗的生产和宫颈癌的防控具有重要价值。
附图说明
33.为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
34.图1为hpv11型兔多抗和鼠单抗分别稀释200和5000倍后检测vlp抗原的标准曲线。
具体实施方式
35.下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
36.一般地，连同本文描述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学以及蛋白和核酸化学和杂交使用的命名法和其技术是本领域众所周知和通常使用的那些。除非另有说明，本发明的方法和技术一般根据本领域众所周知，且如各种一般和更具体的参考文献中所述的常规方法来进行，所述参考文献在本说明书自始至终引用和讨论。酶促
反应和纯化技术根据制造商的说明书、如本领域通常实现的或如本文所述来进行。连同本文描述的分析化学、合成有机化学以及医学和药物化学使用的命名法、以及其实验室程序和技术是本领域众所周知和通常使用的那些。
37.根据本发明的一个方面，本发明提供了一种与11型hpv结合的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段至少包含一个轻链可变区或一个重链可变区，或者同时包含轻链可变区和重链可变区。
38.轻链可变区：
39.所述轻链可变区具有由cdr-l1、cdr-l2、cdr-l3组成的轻链cdr。
40.所述cdr-l1、cdr-l2、cdr-l3的氨基酸序列分别如seq id no:1、2和3所示：
41.cdr-l1:rasqsigtsih(seq id no:1)
42.cdr-l2:yasesis(seq id no:2)
43.cdr-l3:qqssnwpyt(seq id no:3)
44.含有由上述cdr-l1(seq id no:1)、cdr-l2(seq id no:2)和cdr-l3(seq id no:3)组成的轻链cdr的轻链可变区的氨基酸序列优选如seq id no:7所示。
45.或者，所述cdr-l1、cdr-l2、cdr-l3的氨基酸序列分别如seq id no:11、12和13所示：
46.cdr-l1:rasqsigtnih(seq id no:11)
47.cdr-l2:yasesvs(seq id no:12)
48.cdr-l3:qqsnnwpyt(seq id no:13)。
49.含有由上述cdr-l1(seq id no:11)、cdr-l2(seq id no:12)和cdr-l3(seq id no:13)组成的轻链cdr的轻链可变区的氨基酸序列优选如seq id no:17所示。
50.重链可变区：
51.所述重链可变区具有由cdr-h1、cdr-h2、cdr-h3组成的重链cdr。
52.所述cdr-h1、cdr-h2、cdr-h3的氨基酸序列分别如seq id no:4、5和6所示：
53.cdr-h1:nylie(seq id no:4)
54.cdr-h2:vinpgsggsnynenfkg(seq id no:5)
55.cdr-h3:piyygnpwfay(seq id no:6)
56.含有由上述cdr-h1(seq id no:4)、cdr-h2(seq id no:5)和cdr-h3(seq id no:6)组成的重链cdr的重链可变区的氨基酸序列优选如seq id no:9所示。
57.或者，所述cdr-h1、cdr-h2、cdr-h3的氨基酸序列分别如seq id no:14、15和16所示：
58.cdr-h1:nylie(seq id no:14)
59.cdr-h2:vinpgsggfnynekfkg(seq id no:15)
60.cdr-h3:piyygypgfay(seq id no:16)
61.含有由上述cdr-h1(seq id no:14)、cdr-h2(seq id no:15)和cdr-h3(seq id no:16)组成的重链cdr的重链可变区的氨基酸序列优选如seq id no:19所示。
62.在一些优选的实施方式中，与11型hpv结合的抗体或其抗原结合片段同时含有轻链可变区和重链可变区。当同时含有轻链可变区和重链可变区时，轻链cdr和重链cdr优选按照如下(a)和(b)两种方式组合：
63.(a)组成轻链可变区轻链cdr的cdr-l1、cdr-l2、cdr-l3的氨基酸序列分别如seq id no:1、2和3所示；同时，组成重链可变区重链cdr的cdr-h1、cdr-h2、cdr-h3的氨基酸序列分别如seq id no:4、5和6所示。
64.在该组合方式中，优选的实施方式为轻链可变区的氨基酸序列如seq id no:7所示，同时重链可变区的氨基酸序列如seq id no:9所示。
65.更优选地实施方式为由杂交瘤细胞株1f9分泌产生的11型hpv特异性结合的单克隆抗体1f9，1f9为鼠源单克隆抗体，轻链可变区的氨基酸序列如seq id no:7所示，同时重链可变区的氨基酸序列如seq id no:9所示，为igg3亚型，轻链是κ型。杂交瘤细胞株1f9的保藏编号为：cgmcc no.45155。
66.(b)组成轻链可变区轻链cdr的cdr-l1、cdr-l2、cdr-l3的氨基酸序列分别如seq id no:11、12和13所示；同时组成重链可变区重链cdr的cdr-h1、cdr-h2、cdr-h3的氨基酸序列分别如seq id no:14、15和16所示。
67.在该组合方式中，优选的实施方式为轻链可变区的氨基酸序列如seq id no:17所示，同时重链可变区的氨基酸序列如seq id no:19所示。
68.更优选地实施方式为由杂交瘤细胞株1b5分泌产生的11型hpv特异性结合的单克隆抗体1b5，1b5为鼠源单克隆抗体，轻链可变区的氨基酸序列如seq id no:17所示，同时重链可变区的氨基酸序列如seq id no:19所示，为igg1亚型，轻链是κ型。杂交瘤细胞株1b5的保藏编号为：cgmcc no.45156。
69.本发明通过杂交瘤技术筛选获得针对11型hpv的鼠源单克隆抗体及杂交瘤细胞，通过直接elisa法检测该单抗的特异性，发现该抗体与hpv6、hpv 16、hpv 18、hpv31、hpv 33、hpv 45、hpv 52、hpv 58等抗原均无交叉反应，特异性良好。通过elispot仪器进行假病毒中和实验法检测该抗体的中和活性，显示对hpv11型假病毒具有高度的中和活性。同时对该抗体的重链可变区及轻链可变区基因进行测序，并对其cdr区进行分析，对该抗体进行了全面表征。
70.抗体与抗原的表位是一一对应的关系，一个抗原表位对应一个相应的抗体，抗原表位分线性表位和空间表位，中和表位多数为空间表位，抗原的中和表位是产生中和抗体的结构基础，也是作为疫苗候选抗原激发有效免疫应答的前提。由于抗体产生的异质性和多样性，即使针对同一抗原也会产生具有不同cdr区的抗体，而筛选获得具有中和活性的优质抗体概率很低，该抗体具有唯一性。
71.本领域公知，抗体的结合特异性及亲合力均主要由cdr序列决定，根据成熟、公知的现有各项技术可轻易地将非cdr区域的氨基酸序列改变而获得具有相类似的生物活性的变体。本发明涉及的具有与上述cdr序列完全相同的cdr序列的单克隆抗体变体，因其具有与本发明所述的与11型hpv结合的抗体完全相同的cdr序列，因此具有相类似的生物活性。
72.抗原结合片段为与母体抗体相同特异性的抗体片段，例如可以为但不限于为f(ab’)2、fab’、fab、fv、scfv、dsfv、双特异抗体和抗体最小识别单位中的一种或多种。除上述功能片段外，还包括半衰期已增加的任何片段。
73.这些功能片段通常具有与其来源抗体相同的结合特异性。本领域技术人员根据本发明说明中记载的内容推断，本发明的抗原结合片段可以通过比如酶消化的方法(包括胃蛋白酶或木瓜蛋白酶)和/或通过化学还原分裂二硫键的方法获得上述的功能片段。
74.抗原结合片段还可以通过也是本领域技术人员所知的重组遗传学技术或通过例如自动肽合成仪，通过肽合成获得；或者通过宿主细胞表达编码上述功能片段的基因得到。
75.本发明提供的与11型hpv结合的抗体或其抗原结合片段除去cdr区域，其余部分序列来源物种包括但不限于小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、兔子、雪貂、猫、狗、山羊、绵羊、奶牛、猪、马、猴和人中的一种或多种。
76.本发明与11型hpv结合的抗体或其抗原结合片段中的cdr区域来源于小鼠。所述抗体或其抗原结合片段的全部序列可以均来源于小鼠，如本发明实施例提供的单克隆抗体1f9和1b5均为鼠源抗体；可选地，所述抗体或其抗原结合片段中的除去cdr区域其他区域，例如轻链恒定区、重链恒定区，或者轻链可变区和重链可变区中除去cdr区的骨架部分也可以选自非鼠源的氨基酸序列，例如可以为但不限于为人鼠嵌合抗体或人源化抗体。
77.当与11型hpv结合的抗体为完整的抗体分子时，其抗体类型例如可以为但不限于为igg1、igg2a、igg2b、igg2c、igg3、igg4、iga、igm、ige或igd。在本领域技术人员已知抗体的cdr区域或轻链和重链可变区的前提下，本领域技术人员可以采用本领域常规方法来获得不同类型的抗体，例如将可变区基因与相应的重链或重链恒定区编码基因融合，并在宿主细胞中表达融合蛋白，以获得不同类型的抗体。
78.根据本发明的另一个方面，本发明还提供了一种生物材料，包括核酸片段、载体或宿主细胞。
79.核酸片段：选自(a1)或(a2)
80.(a1)、其编码与11型hpv结合的抗体或其抗原结合片段；在一些优选的实施方式中，核酸片段为dna，其含有序列如seq id no:8或seq id no:18所示的编码轻链可变区的dna片段；和/或，序列如seq id no:10或seq id no:20所示的编码重链可变区的dna片段。
81.(a2)、与(a1)中定义的核酸片段互补的核酸片段。
82.载体：包括如上所述的核酸片段，所述载体还可以包括编码其他组成元件的部分，例如可以为但不限于为编码调控序列或标记基因等。载体例如可以为但不限于为原核表达载体、真核表达载体或昆虫表达载体。
83.宿主细胞：所述宿主细胞转化有上述载体，以使上述载体实现克隆或表达。
84.根据本发明的另一个方面，本发明还提供了两株杂交瘤细胞，分别为杂交瘤细胞株1f9和杂交瘤细胞株1b5，保藏信息如下：
85.杂交瘤细胞株1f9：保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)；保藏编号为：cgmcc no.45155；保藏单位地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏日期为：2022年05月12日。
86.杂交瘤细胞株1b5：保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)；保藏编号为：cgmcc no.45156；保藏单位地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏日期为：2022年05月12日。
87.根据本发明的另一个方面，本发明还提供了一种用于检测11型hpv l1抗原的试剂或试剂盒，所述产品包含所述与11型hpv结合的抗体或其抗原结合片段。可选的实例有，试剂或试剂盒包含与11型hpv结合的抗体，例如单克隆抗体1f9或单克隆抗体1b5；试剂盒例如可以为但不限于为elisa检测试剂盒、western blot检测试剂盒、免疫组化检测试剂盒或胶体金检测试纸等本领域常规检测方法的试剂盒。可以理解的是，所述试剂中还可以包含本
领域常规的试剂，例如可以但不限于包括冻干保护剂，缓冲物质和溶剂等一种或多种；试剂盒还可以包含本领域常规的试剂或耗材，例如可以为但不限于包括缓冲液、封闭液、二抗、显色物质、标记物和反应底物、磁性微粒、试纸及其支撑部件等一种或多种。
88.根据本发明的另一个方面，本发明还提供了所述的抗体或其抗原结合片段，所述的生物材料，所述的杂交瘤细胞株或用于检测11型hpv l1抗原的试剂或试剂盒的应用，应用的实例例如可以为但不限于为如下(x1)～(x4)：
89.(x1)疫苗质控；
90.(x2)制备用于疫苗质控的产品；
91.(x3)制备用于临床病原学检测的产品；
92.(x4)制备用于流行病调查的产品。
93.本发明提供的与11型hpv结合的抗体或其抗原结合片段对hpv11 l1vlps和假病毒具有高度的特异性和中和活性，表明该抗体或其抗原结合片段是针对hpv11 l1蛋白中和表位的抗体，基于与11型hpv结合的抗体或其抗原结合片段良好的抗原性，可以特异性快速鉴别并定量hpv11 l1蛋白，以对疫苗有效抗原成分的含量及活性进行评价，从而广泛应用于hpv疫苗的生产质控、临床病原学检测及流行病调查，对hpv疫苗的生产和宫颈癌的防控具有重要价值。
94.在一些优选的实施方式中建立了双抗夹心间接elisa检测hpv11 l1抗原的方法，使用hpv11 l1多抗包被，例如兔多抗，加入待检抗原孵育，加入所述与11型hpv结合的单克隆抗体1f9或1b5孵育，加入抗鼠抗体酶标复合物，例如抗鼠igg酶标复合物，进行显示检测。
95.结果显示，该方法具有良好的特异性、灵敏度、线性和准确度，可以快捷鉴别并定量hpv11 l1抗原，对疫苗有效抗原成分的含量及活性进行评价。由于所使用是检测抗体为中和活性单抗，因此，该方法可以对疫苗抗原的中和表位进行很好的质控和表征，在一定程度上指征了疫苗成品的免疫原性，因此该方法具有取代动物实验评价疫苗中和活性的潜在优势，规避了动物实验导致的检测波动大、检测周期长、成本高昂的问题，同时也符合国际社会倡导的动物福利原则。
96.该方法采用hpv11 l1多抗进行包板，可以最大限度地捕获待检抗原，提高灵敏度，加入待检抗原，再加入hpv11型单克隆抗体(1f9或1b5)，最后加入抗鼠酶标抗体进行显色和读值。传统的双抗体夹心elisa法需要对其中的一个单抗进行标记，尤其是应用于多价hpv疫苗时，需要对多个型别的hpv单抗分别进行标记，增大了工作量和成本，而本发明针对多价hpv疫苗不同价型抗原定量检测时，则采用抗鼠酶标抗体为通用的显色抗体，大大提高了检测的便利性，降低了成本。
97.实施例1单克隆抗体的制备
98.1.1小鼠免疫
99.hpv 11型原液分别与佐剂cfa和ad11.15混合，免疫balb/c小鼠，第14天取小鼠尾血，使用间接elisa方法进行尾血中抗体效价的评价。采用hpv 11型原液包被酶标板(1：100稀释)，每孔加入100μl，4℃过夜反应；使用pbs溶液洗板3次，使用5％milk-pbs在室温封闭1hr；然后使用pbs溶液洗板1次后，加入梯度稀释的小鼠尾血，室温反应1hr；然后使用pbs溶液洗板3次，拍干后，加入1:2000稀释的hrp标记的山羊抗小鼠fc二抗，室温反应1hr，pbs溶液洗板5次后，拍干，加入等体积的底物a液和b液，避光、室温条件下反应，20min；然后加入
50μl终止液，混匀后在酶标仪上读取od
450
和od
630
值，输出od＝od
450-od
630
。取尾血滴度均超过1/50000的小鼠进行后续实验。
100.1.2细胞融合及单克隆筛选
101.处死小鼠取脾细胞分别与sp2/0细胞融合，在选择培养基中培养为单克隆细胞株后挑克隆，共挑取9个96孔板的克隆。使用hpv 11型原液包被酶标板(1：100稀释)，进行单克隆筛选，方法同上。从9个96孔板共846个克隆中初筛共保留56个od≥1.0的阳性克隆。将初筛阳性克隆从96孔板中扩大培养至48孔板，培养2-3天后，进行复筛，保留复筛od≥1.0强阳性克隆13株。
102.1.3克隆特异性筛选
103.对13株阳性克隆细胞上清进行特异性检测，其中1b5、1d2、1f9、2f8、2g12、3h5、4a2、4a5、5c3和8h5共10株为特异识别hpv11 vlp抗原的阳性克隆，检测结果见表1。方法如下：分别将hpv 6、hpv11、hpv 16、hpv 18、hpv 31、hpv 33、hpv 45、hpv 52、hpv 58共9种亚型vlp抗原稀释至1μg/ml，每孔加入100μl，4℃过夜反应；使用pbs溶液洗板3次，使用5％milk-pbs在室温封闭1hr；然后使用pbs溶液洗板1次后，加入20倍稀释后的不同克隆的杂交瘤细胞上清，室温反应1hr；然后使用pbs溶液洗板3次，拍干后，加入1:10000稀释的hrp标记的山羊抗小鼠fc二抗，室温反应1hr，pbs溶液洗板5次后，拍干，加入等体积的底物a液和b液，避光、室温条件下反应，20min；然后加入50μl终止液，混匀后在酶标仪上读取od
450
和od
630
值，输出od＝od
450-od
630
。
104.表1.抗体的特异性elisa检测(od值*)
[0105][0106]
*所有数值均为复孔的平均值；vlp为类似病毒样颗粒
[0107]
1.4中和活性检测
[0108]
将10株特异识别hpv11 l1的阳性克隆细胞上清进行假病毒中和活性检测，检测结果见表2，经假病毒中和实验验证，1b5、1d2、1f9、2f8、2g12、4a2、4a5、5c3和8h5共9株克隆的细胞上清都具有较高中和活性。方法如下：1)用dmem完全培养基(含10％胎牛血清、1％双
抗、1％l-glu和1％g418)稀释293ft细胞并加入96孔细胞培养板中，37℃培养过夜；2)用dmem完全培养基倍比稀释hpv6-gfp假病毒至所需浓度(每孔荧光斑点数约400)；3)用deme完全培养基倍比稀释待检hpv11型杂交瘤细胞上清液；4)用deme完全培养基倍比稀释hpv11型单克隆抗体(宾州大学)作为对照组；5)各取60μl稀释后的细胞上清液和假病毒进行混匀，然后放入4℃反应1小时；6)取100μl的混合液缓慢加入铺有293ft细胞的96孔细胞培养板中，37℃培养60-96小时；6)弃去细胞培养液，用elspot(aid)进行读值，其中荧光斑点数值≤阳性荧光斑点数平均值/2结果判定中和活性为阳性。检测结果显示，接收到的hpv假病毒(三药生物)符合预期的要求，每个孔的荧光斑点数符合要求(约400个)，随着假病毒稀释倍数的提高荧光斑点数也降低，hpv11型细胞上清克隆株1b5、1d2、1f9、2f8、2g12、4a2、4a5、5c3和8h5都具有较高的中和活性，稀释5120倍后大多数仍具有中和活性。
[0109]
表2：中和活性检测
[0110][0111][0112]
1.5腹水制备及抗体纯化
[0113]
根据细胞上清的亲和力、特异性及中和活性结果选择克隆1f9和1b5进行腹水制备，取杂交瘤细胞分别接种4只balb/c小鼠，在第10～14天收集腹水，用蛋白g纯化腹水，获得纯化抗体。
[0114]
1.6抗体灵敏度检测
[0115]
根据细胞上清的亲和力、特异性及中和活性结果选择克隆1f9和1b5进行腹水制备及抗体纯化，抗体1f9和1b5灵敏度均可达到0.0005μg/ml，见表3。
[0116]
表3.抗体灵敏度检测
[0117][0118]
注：nc为阴性对照5％milk-pbs；阳性判断标准为od值》nc值的2.1倍；nan表示超出最大检测限值。
[0119]
1.7抗体型别鉴定
[0120]
对抗体1b5和1f9进行亚型鉴定，检测结果见表4。抗体1b5是igg1亚型，轻链是κ型，而1f9是igg3亚型，轻链是κ型。
[0121]
表4：抗体亚型鉴定
[0122][0123][0124]
注：nan表示超出最大检测限值
[0125]
实施例2抗体基因测序及分析
[0126]
提取1f9和1b5杂交瘤细胞株的总rna，经primescript
tm 1st strand cdna synthesis kit(takara,cat#6110a)反转录，经rt-pcr法扩增抗体vh及vl基因，克隆至puc-19t载体，通过载体上m13通用引物进行测序，结果如下：
[0127]
单克隆抗体1f9
[0128]
2.1 vh区-1f9(leader sequence-variable region)
[0129]
1)dna sequence:417bp(seq id no:10)
[0130]
atggaatggagcggagtctttatctttctcctgtcagtaactgcaggtgttcactcccaggtccagctgcagcagtctggagctgagctggtaaggcctgggacttcagtgaaggtgtcctgcaaggcttctggatacgccttcaccaattacttgatagagtggataaggcagaggcctggacagggccttgagtggattggagtgattaatcctggaagtggtggtagtaactacaatgagaacttcaagggcaaggcaacactgactacagacaaatcctccagcactgcctacatgcagctcagcagcctgacatctgatgactctgcggtctatttctgtgcaagaccaatctactatggtaacccctggtttgcttactggggccaagggactctggtcactgtctctgca
[0131]
2)amino acid sequence:139aa(seq id no:9)
[0132]
mewsgvfifllsvtagvhsqvqlqqsgaelvrpgtsvkvsckasgyaftnyliewirqrpgqglewigvinpgsggsnynenfkgkatlttdkssstaymqlssltsddsavyfcarpiyygnpwfaywgqgtlvtvsa
[0133]
cdr-h1:nylie(seq id no:4)
[0134]
cdr-h2:vinpgsggsnynenfkg(seq id no:5)
[0135]
cdr-h3:piyygnpwfay(seq id no:6)
[0136]
2.2 vl区-1f9(leader sequence-variable region)
[0137]
1)dna sequence:381bp(seq id no:8)
[0138]
atggtatccacacctcagttccttgtatttttgcttttctggattccagcctccagaggtgacatcttgctgactcagtctccagccatcctgtctgtgagtccaggagaaagagtcagtttctcctgcagggccagtcagagcattggcacaagcatacactggtttcagcaaagaacaaatggttctccaaggcttctcataaagtatgcttctgagtctatctctgggatcccttccaggtttagtggcagtggatcagggacagattttactcttagcatcaacagtgtggagtctgaagatattgcagcttattactgtcaacaaagtagtaactggccgtacacgttcggaggggggaccaagctggaaataaaa
[0139]
2)amino acid sequence:127aa(seq id no:7)
[0140]
mvstpqflvfllfwipasrgdilltqspailsvspgervsfscrasqsigtsihwfqqrtngsprllikyasesisgipsrfsgsgsgtdftlsinsvesediaayycqqssnwpytfgggtkleik
[0141]
cdr-l1:rasqsigtsih(seq id no:1)
[0142]
cdr-l2:yasesis(seq id no:2)
[0143]
cdr-l3:qqssnwpyt(seq id no:3)
[0144]
单克隆抗体1b5
[0145]
2.3 vh区-1b5(leader sequence-variable region)
[0146]
1)dna sequence:417bp(seq id no:20)
[0147]
atggaatggagcggagtctttatctttctcctgtcagtaactgcaggtgttcactcccaggtccagctgcagcagtctggagctgagctggtaaggcctgggacttcagtgaaggtgtcctgcaaggcttctggatacgccttcactaattacttgatagagtgggtaaaacagaggcctggacagggccttgagtggattggagtgattaatcctggaagtggtggttttaactacaatgagaagttcaagggcaaggcaacactgactgcagacaaatcctccagcactgcctacatgcagctcagcagcctgacatctgatgactctgcggtctatttctgtgcaagacccatctactatggttaccctgggtttgcttactggggccaagggactctggtcactgtctctgca
[0148]
2)amino acid sequence:139aa(seq id no:19)
[0149]
mewsgvfifllsvtagvhsqvqlqqsgaelvrpgtsvkvsckasgyaftnyliewvkqrpgqglewigvinpgsggfnynekfkgkatltadkssstaymqlssltsddsavyfcarpiyygypgfaywgqgtlvtvsa
[0150]
cdr-h1:nylie(seq id no:14)
[0151]
cdr-h2:vinpgsggfnynekfkg(seq id no:15)
[0152]
cdr-h3:piyygypgfay(seq id no:16)
[0153]
2.4 vl区-1b5(leader sequence-variable region)1)dna sequence:381bp(seq id no:18)
[0154]
atggtatccacacctcagttccttgtatttttgcttttctggattccagcctccagaggtgacatcttgctgactcagtctccagccatcctgtctgtgagtccaggagaaagagtcagtttctcctgcagggccagtcagagcat
tggcacaaacatacactggtatcagcaaagaacaaatggttctccaaggcttctcataaagtatgcttctgagtctgtctctgggatcccttccaggtttcgtggcagtggatcagggacagattttactcttagcatcaacagtgtggagtctgaagatattgcagattattactgtcaacaaagtaataactggccgtacacgttcggaggggggaccaagctggaaataaaa
[0155]
2)amino acid sequence:127aa(seq id no:17)
[0156]
mvstpqflvfllfwipasrgdilltqspailsvspgervsfscrasqsigtnihwyqqrtngsprllikyasesvsgipsrfrgsgsgtdftlsinsvesediadyycqqsnnwpytfgggtkleik
[0157]
cdr-l1:rasqsigtnih(seq id no:11)
[0158]
cdr-l2:yasesvs(seq id no:12)
[0159]
cdr-l3:qqsnnwpyt(seq id no:13)
[0160]
实施例3单克隆抗体的应用
[0161]
3.1双抗夹心间接elisa方法的建立
[0162]
具体步骤如下：
[0163]
1)用包被液(碳酸盐缓冲液)稀释hpv11(r150)兔多抗200倍、500倍、1000倍和2000倍，100μl/孔，4℃，包被(碳酸盐缓冲液)，过夜；
[0164]
2)添加5％脱脂乳(pbs配)，200μl/孔，37℃封闭2h；
[0165]
3)2％脱脂乳稀释hpv11型vlp原液(r621(11)180725p)至120μg/ml，然后3倍倍比稀释至11个梯度，100μl/孔，37℃，1h；
[0166]
4)用2％脱脂乳5000倍稀释对应hpv11(1f9或1b5)鼠单抗，100μl/孔，37℃，1h；
[0167]
5)2％脱脂乳5000倍/10000倍稀释羊抗鼠lgg-hrp二抗(bio-rad，100μl/孔，37℃，1h；
[0168]
6)添加tmb显色液，100μl/ml，37℃显色10min；
[0169]
7)添加50μl/孔浓硫酸终止反应，酶标仪测定450nm、参比波长620nm读值。
[0170]
结果如表5所示，其中ab行为兔多抗200倍稀释；cd行为兔多抗500倍稀释；ef行为兔多抗1000倍稀释；gh行为兔多抗2000倍稀释。
[0171]
表5不同稀释倍数的hpv11型兔多抗和鼠单抗检测vlp抗原的od值
[0172] 123456789101112a3.2673.2363.2623.1282.9292.2951.3550.6720.2830.1290.0710.06b3.3023.1713.1683.0452.6682.1881.2840.6850.2760.1190.0710.053c3.2283.1913.1943.0012.6362.0611.0160.5910.2310.0950.0530.041d3.2483.1533.1822.9782.5521.9951.1410.550.2320.0990.0540.039e3.2673.1513.1552.9512.3851.8391.1050.5180.1940.0830.0460.035f3.2473.1223.12.9242.4651.8271.0360.4310.1910.0830.0440.034g3.2023.1033.0582.7182.3651.7350.8680.3570.1310.0590.0310.027h3.4013.2493.2783.0472.4761.8110.9480.3740.1420.060.0330.031
[0173]
检测结果通过4参数曲线显示，如下抗体反应浓度条件下具有良好的线性关系，即hpv11型兔多抗和鼠单抗稀释倍数分别为200和5000，vlp抗原起始稀释浓度120μg/ml，具体检测结果如图1所示，曲线参数下表所示：
[0174]
表6
[0175][0176]
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。