蒙古鲌分布和迁移评估方法与流程

1.本发明属于动物分子遗传学领域，涉及一种鱼类分布和迁移评估方法，尤其涉及一种蒙古鲌分布和迁移评估方法。


背景技术：

2.蒙古鲌平时生活在水流缓慢的河湾或湖泊的中、上层，游动敏捷，活动较分散。5-7月集群繁殖，冬季多集中在河流深水处或湖泊的深潭越冬。幼鱼以浮游动物和水生昆虫为食；成鱼则以小鱼为主食。生殖季节在5-7月。产卵盛期在6月。在有流水的环境中产卵，卵具粘性，白色，粘附在水草上发育孵化。怀卵量较大，体长400
‑‑
600mm的个体怀卵量为40-70万粒。
3.近年来，野生蒙古鲌资源受到严重破坏。长江野生蒙古鲌数量的急剧减少，引来了越来越多关注。由于长江水量大、江面宽，蒙古鲌野生资源数量难以准确评估，进而蒙古鲌在长江中的分布和迁移规律也无法准确研究。


技术实现要素：

4.为了解决背景技术中存在的上述技术问题，本发明提供了一种可准确评估野生蒙古鲌资源的蒙古鲌分布和迁移评估方法。
5.为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
6.一种蒙古鲌鉴定用引物，其特征在于：所述蒙古鲌鉴定用引物是蒙古鲌双重pcr微卫星引物，所述蒙古鲌双重pcr微卫星引物是5组，每组蒙古鲌双重pcr微卫星引物包括两对引物序列，5组蒙古鲌双重pcr微卫星引物分别是：
7.第i组，包括蒙1引物对以及蒙2引物对；其中，蒙1引物对的正向引物f是agcaccttatttctcccactt，反向引物r是ggcgtgcttcacttctctct；蒙2引物对的正向引物f是caatggaaggtcaagccaat，反向引物r是ggaatgtccccacaattcgc；
8.第ii组，包括蒙3引物对以及蒙4引物对；其中，蒙3引物对的正向引物f是tgatgcatgtagcgcctcac，反向引物r是agatcatgtggggtctgtgac；蒙4引物对的正向引物f是agctgggctgagagcagaag，反向引物r是gcaaccagggacgtacatat；
9.第iii组，包括蒙5引物对以及蒙6引物对；其中，蒙5引物对的正向引物f是cccgagccttactcctttct，反向引物r是ctcagaggcgagaaaaccag；蒙6引物对的正向引物f是acaatccgccacctaggaac，反向引物r是aacaagaagccaaggcaaga；
10.第iv组，包括蒙7引物对以及蒙8引物对；其中，蒙7引物对的正向引物f是gcagagatggaggaggatgt，反向引物r是cggatggttcctggataaag；蒙8引物对的正向引物f是caatgtacgccttgggtttt，反向引物r是tggcagctttgcaaatacac；
11.第v组，包括蒙9引物对以及蒙10引物对；其中，蒙9引物对的正向引物f是gctcatgtccgatattggtg，反向引物r是ccatctttgtggggacattt；蒙10引物对的正向引物f是aaacagggctgaatgctttg，反向引物r是tgagggaggtaccagttgag。
12.一种基于如前所述的蒙古鲌鉴定用引物在鉴定蒙古鲌时的应用。
13.一种基于如前所述的蒙古鲌鉴定用引物在鉴定蒙古鲌亲缘关系的应用。
14.一种基于如前所述的蒙古鲌鉴定用引物的蒙古鲌的分布和迁移评估方法，其特征在于：所述评估方法包括以下步骤：
15.1)挑选n个蒙古鲌家系的健康蒙古鲌，每个蒙古鲌家系中均包括m尾健康蒙古鲌；
16.2)在步骤1)挑选得到的健康蒙古鲌体内植入超声波标记物，并将蒙古鲌养殖至伤口愈合；每个蒙古鲌家系的健康蒙古鲌中植入超声波标记物的数量是s，所述s≥5％m；
17.3)将伤口愈合的蒙古鲌以及除超声波标记物标记外剩余的健康蒙古鲌在流动水域放流；
18.4)对放流的蒙古鲌进行移动追踪及固定监测，获取蒙古鲌的移动数据；
19.5)根据步骤4)的结果，在流动水域中对蒙古鲌进行回捕；
20.6)利用蒙古鲌鉴定用引物对回捕得到的蒙古鲌进行亲缘关系鉴定；
21.7)计算在回捕蒙古鲌时所在流动水域中的所有蒙古鲌的数量；
22.8)根据步骤7)的结果对蒙古鲌的分布和迁移进行评估。
23.作为优选，本发明所采用的步骤6)的具体实现方式是：
24.6.1)从回捕得到的蒙古鲌的鳍条中提取dna；
25.6.2)利用蒙古鲌鉴定用引物对步骤6.1)所得到的dna进行pcr扩增，得到扩增产物；
26.6.3)将扩增产物在10％的聚丙烯酰胺胶上进行电泳分离；
27.6.4)使用mega5.0软件和population软件对步骤6.3)的分离结果做聚类发育树；
28.6.5)根据6.4)所得到的聚类发育树鉴定回捕得到的蒙古鲌的亲缘关系。
29.作为优选，本发明所采用的步骤6.2)中，pcr反应体系是25ul：10
×
pcr buffer 3ul，2.5mmol/l dntp 2ul，2mmol/lmgcl23ul，上下游引物各1ul，5u/μltaq酶0.5ul，dna模板2ul，超纯水10.5ul；
30.所述pcr反应程序是：94℃预变性3min；94℃变性30s，退火温度复性30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸10min；4℃保存。
31.作为优选，本发明所采用的步骤7)的具体实现方式是：
32.7.1)统计在流动水域中回捕得到的蒙古鲌的相关数据，以q
回捕
表示回捕蒙古鲌时所在的流动水域，则所述相关数据包括：在q
回捕
中回捕得到蒙古鲌的被植入超声波标记的蒙古鲌的数量a、根据步骤4)的监测数据获取在q
回捕
中所有植入超声波标记的蒙古鲌数量b、在q
回捕
中回捕得到的蒙古鲌数量d、基于步骤6)在数据d中统计与数据a具有相同亲缘关系的数量c；
33.7.2)根据公式(c+a)
÷
(a
÷
b)
÷
((c+a)
÷
d)计算在q
回捕
中的所有蒙古鲌的数量。
34.作为优选，本发明所采用的步骤1)中挑选的标准是蒙古鲌的体长不低于40厘米。
35.作为优选，本发明所采用的步骤2)中超声波标记物的规格为v13-1h，发射频率为69khz。
36.作为优选，本发明所采用的步骤2)中植入的具体实现方式是：采用酒精消毒的手术刀在腹鳍与肛门之间的腹侧中线位置切开0.3厘米的切口，切开腹部，把用酒精消过毒的超声波标记塞入蒙古鲌腹腔内，最后用可降解的缝线缝合伤口，缝合结束后，用红霉素软膏
涂抹伤口，并注射氟苯尼考消炎。
37.作为优选，本发明所采用的步骤4)中放流的蒙古鲌进行移动追踪及固定监测的地点可以是例如分布在长江的江段，包括长江上游、中游、下游以及各支流中的蒙古鲌活动频繁区域。移动追踪系统包括超声波接收机(vr100)、水下听筒(非定向水下听筒vh100、定向水下vh110)、gps接收机、快艇。固定监测由超声波接收仪(vr2c)、读取器、电脑、vue读取软件组成，超声波接收仪俗称固定站。超声波数据用超声波接收仪(vr100)连接数据线直接用软件下载。前期每周读取数据一次，后期每月下载数据一次。
38.与现有技术相比，本发明具有以下的优点：
39.本发明提供的一种研究蒙古鲌在长江中的分布和迁移规律的方法，该方法较传统方法更为准确的评估长江每个江段野生蒙古鲌资源的数量，为保护该物种提供数据基础。利用本方法还可以对蒙古鲌进行亲缘关系分析，避免蒙古鲌个体近亲繁殖。本方法可以有效评价放流效果，进而为放流方式提出改进方法。
附图说明
40.图1是24尾蒙古鲌pcr产物电泳图；
41.图2是18尾蒙古鲌样本亲缘关系聚类分析图；
42.图3是24尾蒙古鲌样本亲缘关系聚类分析图。
具体实施方式
43.下面结合具体实施方式对本发明所提供的技术方案做详细说明：实施例1蒙古鲌dna的提取：
44.采用天根生化科技(北京)有限公司的dna提取试剂盒提取蒙古鲌鳍条dna，具体提取方法(即，dna提取试剂盒的使用说明书)如下：
45.1)取100mg蒙古鲌鳍条，加入190ul的ddh2o至200ul体系；
46.2)依次加入180ul buffer gb，20ul proteinase k和10ul rnase用移液枪充分吸打混匀，放入水浴锅中于56℃水浴10min；
47.3)将上述溶液转移至spin column中12000rpm离心2min，弃滤液；
48.4)将500ul的bufferwa加入至spin column中12000rpm离心1min，弃滤液；
49.5)将500ul的bufferwb加入至spin column中12000rpm离心1min，弃滤液；(注：请确认buffer wb中已加入指定体积的100％乙醇，请沿spincolumn管壁四周加入buffer wb，这样有助于完全冲洗粘附于管壁的盐份)；
50.6)重复步骤5)；
51.7)将spin column安置于collection tube上12000rpm离心2min；
52.8)将spin column安置于新的离心管上，在膜的中央处加入50至200ul的灭菌水或elution buffer，室温静置5min(注：将灭菌水或elution buffer加热至65℃使用时有利于提高洗脱效率)；
53.9)12000rpm离心2min，洗脱dna。
54.实施例2微卫星引物的选择和筛选
55.对蒙古鲌高通量测序数据，利用misa软件对微卫星位点进行了预测，根据预测结
果再次进行筛选，筛选标准为ssr序列的两端各留有100bp以上长度，以此作为有效ssr。初步筛选微卫星位点经过反复多次pcr扩增，扩增产物经3％凝胶电泳检测，扩增出目的条带的引物进行10％的聚丙烯酰胺胶上进行电泳分离。把扩增条带较好的引物根据产物大小进行分类，不同产物大小的引物进行两两组合，重新在24个蒙古鲌样本进行pcr扩增，最终筛选到效果较好的5组双重蒙古鲌pcr引物，如表1所示。pcr反应体系是25ul：10
×
pcrbuffer 3ul，2.5mmol/l dntp 2ul，2mmol/lmgcl23ul，上下游引物各1ul，5u/μltaq酶0.5ul，dna模板2ul，超纯水10.5ul。pcr反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，退火温度复性30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸10min；4℃保存，电泳结果如图1所示。图1说明了这24尾蒙古鲌样本在双重pcr反应条件下扩增效果较好，所用引物为组别1和组别2的引物，在图1中，从左至右，前24个样本是组别1的扩增产物，后24个样本是组别2的扩增产物。扩出的条带清晰，杂带较少，完全可以应用于蒙古鲌的亲缘关系分析。
56.表1微卫星位点具体信息
[0057][0058]
实施例3
[0059]
从3个蒙古鲌家系中各选取6个子代样本，其中1-6样本为同一家系子代，7-12样本为同一家系子代，13-18样本为同一家系子代，共18个样本。从每条鱼的鳍条中提取dna。以所取基因组dna为模板，用前述引物对分别对18个样本进行pcr扩增，pcr反应体系是25ul：10
×
pcr buffer 3ul，2.5mmol/l dntp 2ul，2mmol/lmgcl23ul，上下游引物各1ul，5u/μltaq酶0.5ul，dna模板2ul，超纯水10.5ul。pcr反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，
退火温度复性30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸10min；4℃保存。根据分离结果统计pcr扩增产物的基因型；使用mega5.0软件做聚类发育树，结果如图2所示，18个样本聚类分3个大的分支，其中1-6样本聚为一个分支，7-12样本聚为一个分支，13-18样本聚为一个分支。该实施例说明本专利所述的引物具有鉴定未知蒙古鲌样本是否为同一家系的能力。
[0060]
实施例4利用微卫星位点计算蒙古鲌亲缘关系方法
[0061]
取24尾待测蒙古鲌鳍条样品；提取蒙古鲌样品dna；利用本发明筛选出来的微卫星位点对所有个体dna进行pcr扩增，pcr反应体系是25ul：10
×
pcr buffer 3ul，2.5mmol/ldntp 2ul，mgcl23ul，上下游引物各1ul，5u/μltaq酶0.5ul，dna模板2ul，超纯水10.5ul。pcr反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，退火温度复性30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸10min；4℃保存；把pcr扩增产物在10％的聚丙烯酰胺胶上进行电泳分离；根据分离结果统计pcr扩增产物的基因型；使用mega5.0软件做聚类发育树，结果如图3所示；根据聚类分析图鉴定个体之间的亲缘关系，图3显示该图中的24个蒙古鲌个体为3个群体，其中1、2、4、6、9、11、13、16、18、19为一个群体，5、7、8、14、21、23为一个群体，3、12、17、20、22、24为一个群体。利用本方法可用于推测跟被植入超声波放流标记的蒙古鲌有亲缘关系的蒙古鲌。
[0062]
不难看出，基于实施例1至实施例4，本发明实为提供了一种蒙古鲌的分布和迁移评估方法，该评估方法包括以下步骤：
[0063]
1)挑选n个蒙古鲌家系的健康蒙古鲌，每个蒙古鲌家系中均包括m尾健康蒙古鲌，挑选的标准是蒙古鲌的体长不低于40厘米；
[0064]
2)在步骤1)挑选得到的健康蒙古鲌体内植入超声波标记物，并将蒙古鲌养殖至伤口愈合；每个蒙古鲌家系的健康蒙古鲌中植入超声波标记物的数量是s，s≥5％m；超声波标记物的规格为v13-1h，发射频率为69khz，将超声波标记物植入的具体实现方式是：采用酒精消毒的手术刀在腹鳍与肛门之间的腹侧中线位置切开0.3厘米的切口，切开腹部，把用酒精消过毒的超声波标记塞入蒙古鲌腹腔内，最后用可降解的缝线缝合伤口，缝合结束后，用红霉素软膏涂抹伤口，并注射氟苯尼考消炎。
[0065]
3)将伤口愈合的蒙古鲌以及除超声波标记物标记外剩余的健康蒙古鲌在流动水域放流；
[0066]
4)对放流的蒙古鲌进行移动追踪及固定监测，获取蒙古鲌的移动数据。放流的蒙古鲌进行移动追踪及固定监测的地点可以是例如分布在长江的江段，包括长江上游、中游、下游以及各支流中的蒙古鲌活动频繁区域。移动追踪系统包括超声波接收机(vr100)、水下听筒(非定向水下听筒vh100、定向水下vh110)、gps接收机、快艇。固定监测由超声波接收仪(vr2c)、读取器、电脑、vue读取软件组成，超声波接收仪俗称固定站。超声波数据用超声波接收仪(vr100)连接数据线直接用软件下载。前期每周读取数据一次，后期每月下载数据一次。
[0067]
5)根据步骤4)的结果，在流动水域中对蒙古鲌进行回捕；
[0068]
6)利用蒙古鲌鉴定用引物对回捕得到的蒙古鲌进行亲缘关系鉴定(如实施例1至实施例4所记载的全部内容)；
[0069]
7)计算在回捕蒙古鲌时所在流动水域中的所有蒙古鲌的数量，具体的计算方式是：
[0070]
7.1)统计在流动水域中回捕得到的蒙古鲌的相关数据，以q
回捕
表示回捕蒙古鲌时所在的流动水域，则相关数据包括：在q
回捕
中回捕得到蒙古鲌的被植入超声波标记的蒙古鲌的数量a、根据步骤4)的监测数据获取在q
回捕
中所有植入超声波标记的蒙古鲌数量b、在q
回捕
中回捕得到的蒙古鲌数量d、基于步骤6)在数据d中统计与数据a具有相同亲缘关系的数量c；
[0071]
7.2)根据公式(c+a)
÷
(a
÷
b)
÷
((c+a)
÷
d)计算在q
回捕
中的所有蒙古鲌的数量。
[0072]
8)根据步骤7)的结果对蒙古鲌的分布和迁移进行评估。
[0073]
实施例5研究蒙古鲌在长江芜湖江段中的分布
[0074]
挑选健康蒙古鲌十个家系共1万尾蒙古鲌；选出部分体长超过40厘米蒙古鲌植入超声波标记(每个家系约80尾)，并养殖到缝合的伤口愈合的状态；把挑选得到的1万尾蒙古鲌在武汉江段进行放流；对放流的蒙古鲌进行移动追踪和固定监测、数据收集和分析；在芜湖江段对放流的蒙古鲌进行回捕，共捕到蒙古鲌470尾，其中被植入超声波放流标记的蒙古鲌5尾，根据追踪监测得到该区域被植入蒙古鲌33尾。那么根据本发明提供的微卫星标记计算蒙古鲌亲缘关系方法推测跟被植入超声波放流标记的蒙古鲌有亲缘关系的蒙古鲌，结果显示共有85尾，那么本次捕到的470尾蒙古鲌中共有90(85+5)尾。那么根据本方法提供的该区域所有的蒙古鲌的数量计算方法为：(85+5)
÷
(5
÷
33)
÷
(90
÷
470)，即该区域野生蒙古鲌资源的数量为3102尾，其中放流的蒙古鲌数量为(85+5)
÷
(5
÷
33)，即594尾。利用同样的方法即可计算出武汉江段、九江江段、江阴江段或者其他江段蒙古鲌的数量和放流的蒙古鲌的移动规律。