用于检测嗜酸乳杆菌的绝对荧光定量PCR引物对、试剂盒及检测方法与流程

用于检测嗜酸乳杆菌的绝对荧光定量pcr引物对、试剂盒及检测方法
技术领域
1.本发明属于微生物检测领域，具体涉及用于检测嗜酸乳杆菌的绝对荧光定量pcr引物对、试剂盒及检测方法。


背景技术：

2.嗜酸乳杆菌(lactobacillusacidophilus)属于乳杆菌目(lactobacillales)乳杆菌科(lactobacillaceae)乳杆菌属(lactobacillus)，是乳酸菌的一种，为革兰氏阳性菌，主要存在于小肠中。嗜酸乳杆菌作为肠道益生菌在维持肠道菌群平衡以及拮抗致病菌方面具有良好的作用，其主要通过分泌代谢产物(产生乳酸)、竞争排斥、免疫调节等多种方式来发挥益生作用。嗜酸乳杆菌作为重要的益生菌，已经被广泛应用于发酵乳制品、益生菌产品、医药、饲料等的生产中，但是其检测方法相对复杂且不能进行定量分析，因此需要一种更灵敏高效的方法检测产品中嗜酸乳杆菌的含量。
3.目前，国内外主要通过普通pcr对目的基因进行扩增及测序分析以达到对样品中菌种进行分析的目的，其操作简便，设备要求较低，反应迅速，已成为现代菌种检测的主要方法，但该方法灵敏度低，无法对样品中的嗜酸乳杆菌进行定量。
4.鉴于此，建立一种准确、可靠、可定量的嗜酸乳杆菌检测方法对产品中嗜酸乳杆菌检测数量的规范具有重要意义。


技术实现要素：

5.发明目的：针对现有技术中存在的问题，本发明提供了一种用于检测嗜酸乳杆菌的绝对荧光定量pcr引物对、试剂盒及检测方法。
6.技术方案：为了解决上述技术问题，本发明提供了用于检测嗜酸乳杆菌的绝对荧光定量pcr引物对，所述绝对荧光定量pcr引物对包括正向引物la129和反向引物la428，所述正向引物la129的序列如seq id no：1所示，所述反向引物la428的序列如seq id no：2所示。
7.本发明还提供了一种检测嗜酸乳杆菌的试剂盒，所述试剂盒包括所述的绝对荧光定量pcr引物对。
8.其中，所述试剂盒还包括阳性质粒la-pmd19-t/dh5α，所述质粒序列如seq id no：3所示。
9.本发明还提供了所述的特异性引物对、所述的检测试剂盒在检测嗜酸乳杆菌中的应用。
10.本发明还提供了一种嗜酸乳杆菌的定量检测方法，所述定量检测方法采用的是绝对荧光定量pcr方法。
11.其中，所述绝对荧光定量pcr方法具体包括以下步骤：
12.1)以嗜酸乳杆菌的dna作为扩增模板，使用所述引物对进行扩增得到扩增产物；
13.2)利用步骤1)扩增所得的扩增产物，构建重组质粒la-pmd19-t/dh5α，所述质粒序列如seq id no：3所示；
14.3)以构建的la-pmd19-t/dh5α重组质粒作为阳性标准品，进行荧光定量pcr反应，制备标准曲线；
15.4)提取待测样品基因组dna作为模板，与步骤2)的阳性标准品一同进行荧光定量pcr反应，将得到的ct值代入步骤3)所得标准曲线，从而计算出待测样品中嗜酸乳杆菌的基因拷贝数。
16.其中，步骤1)中，pcr扩增反应体系包括：2
×
taqmix12.5μl、ddh2o9.5μl、引物对正反向各1μl、dna模板1μl；反应程序为：95℃预变性5min，95℃变性30s，51℃退火30s，72℃延伸30s，共30个循环，72℃延伸10min。
17.其中，步骤4)中，所述荧光定量pcr的反应体系包括：dna模板2μl，所述引物对正反向各0.4μl，2
×
sybrgreenmastermix10μl，bsa0.2μl，ddh2o7μl；反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，51℃退火30s，72℃延伸30s，反应程序共40个循环；熔解曲线程序：95℃，1min；51℃，30s；95℃，30s。
18.其中，所述待测样品为粪便样品、发酵乳制品、土壤样品、发酵食品、饮料或益生菌产品中的一种或几种。
19.综上，本发明建立了一种能够检测样品中嗜酸乳杆菌的绝对荧光定量pcr方法。首先，根据ncbi中嗜酸乳杆菌全基因组序列设计特异性引物，随后将扩增片段与pmd19-t载体连接，转入大肠杆菌dh5α感受态细胞中，构建阳性重组质粒la-pmd19-t/dh5a。最后，建立标准曲线并对其灵敏性、特异性进行验证。结果表明，建立的嗜酸乳杆菌绝对荧光定量pcr检测方法灵敏度高、特异性好，可用于样品中嗜酸乳杆菌的测定。
20.有益效果：与现有技术相比，本发明具备以下优点：
21.1、本发明所述的方法，用普通pcr扩增时，可检测dna的最低浓度为100pg/μl。用荧光定量pcr扩增时，可检测dna的最低浓度为100fg/μl，比普通pcr检测的灵敏度高1000倍。
22.2、应用普通pcr方法不能对样品中嗜酸乳杆菌进行定量，而荧光定量pcr可对样品中嗜酸乳杆菌进行定量，并且不需要凝胶电泳观察结果，节省时间。
23.3、本发明建立的绝对荧光定量pcr方法可获得样品中嗜酸乳杆菌的绝对数量，便于不同样品之间的比较。
附图说明
24.图1为本发明实施例中特异性引物对的普通pcr筛选结果；
25.图2为本发明实施例中特异性引物对的荧光定量pcr筛选结果；
26.图3是本发明实施例中特异性引物灵敏度验证的pcr检测结果；
27.图4是本发明实施例中目标样本以不同比例混入冗余dna的染料法实时荧光定量pcr扩增曲线与溶解曲线；
28.图5为la-pmd19-t/dh5α重组质粒的标准曲线图；
29.图6为待测样品溶解曲线；
30.图7为普通pcr的灵敏性检测图；
31.图8为荧光定量pcr的灵敏性检测图。
具体实施方式
32.下面通过具体实施例对本发明所述的技术方案给予进一步详细的说明，但有必要指出，以下实施例只用于对发明内容的描述，并不构成对本发明保护范围的限制。
33.本发明所用菌株及试剂材料来源：嗜酸乳杆菌为本实验室从健康人体粪便自行分离获得；重组质粒la-pmd18-t/dh5a委托江苏金唯智生物科技有限公司构建；细菌基因组dna小量纯化试剂盒takaraminibestbacteriagenomicdnaextractionkitver.3.0购自takara公司。实施例1嗜酸乳杆菌特异性引物对的筛选
34.1、引物的设计与合成
35.(1)从ncbi数据库中查找所有注释为lactobacillus acidophilus的序列；
36.(2)分别以18bp、20bp、22bp和24bp长度为单位，从序列第一个碱基开始，每次往后移动两个碱基，对每条序列进行滑窗切割；
37.(3)统计不同长度的短序列出现的次数，保留出现次数大于或等于第一步中搜出的序列条数的短序列；
38.(4)将第(3)步中保留的序列在整个ncbi数据库中精准匹配，若匹配到的均为lactobacillus acidophilus，则该序列可作为该菌lactobacillus acidophilus的候选引物之一；
39.(5)在第(4)步找到的序列中，定位候选引物位置，确定嗜酸乳杆菌的基因序列的种属特异性引物。设计的引物对通过生工生物工程(上海)股份有限公司合成得到。
40.基于上述方法获得的特异性序列(所述序列编码16s ribosomal rna)和设计的引物对如下：
41.[0042][0043][0044]
2、嗜酸乳杆菌总dna的提取：
[0045]
(2.1)菌体的裂解：
[0046]
(2.1.1)用1.5mltube收集1.0
×
109的菌体，12000rpm离心2min，弃上清。
[0047]
(2.1.2)加入180μl的buffergl、20μl的proteinasek(20mg/ml)和10μl的rnasea(10mg/ml)充分振荡混匀，于56℃水浴温育10min，此时溶液应呈透明、澄清状。
[0048]
(2.1.3)加入200μl的buffergb和200μl的100％乙醇，充分吸打混匀。
[0049]
(2.2)将spincolumn安装在collectiontube上，溶液移至spincolumn中，12000rpm离心2min，弃滤液。
[0050]
(2.3)将500μl的bufferwa加入至spincolumn中，12000rpm离心1min，弃滤液。
[0051]
(2.4)将700μl的bufferwb加入至spincolumn中，12000rpm离心1min，弃滤液。
[0052]
(2.5)重复操作步骤2.3。
[0053]
(2.6)将spincolumn安置于collectiontube上，12000rpm离心2min。
[0054]
(2.7)将spincolumn安置于新的1.5ml离心管上，在spincolumn膜的中央处加入50μl的灭菌水，室温静置5min。
[0055]
(2.8)12000rpm离心2min洗脱得到dna。
[0056]
3、使用普通pcr的方法筛选特异性引物
[0057]
(1)实验设计：
[0058]
以植物乳杆wcsf1基因组dna作为阴性对照，以la-pmd19-t质粒dna作为阳性对照，以嗜酸乳杆菌基因组dna为实验组样本，分别以引物对1、引物对2，引物对3和引物对4进行普通pcr实验和琼脂糖凝胶电泳实验，以筛选针对嗜酸乳杆菌的特异性引物。
[0059]
(2)实验方法：普通pcr扩增基因片段
[0060]
反应体系包括：2
×
taqmix12.5μl、ddh2o9.5μl、步骤1设计并合成的引物对(10μmol/l)正反向引物各1μl、步骤2得到的dna模板(20.4ng/μl)1μl；
[0061]
反应程序为：95℃预变性5min，95℃变性30s，51℃退火30s，72℃延伸30s，共30个循环，72℃延伸10min。
[0062]
4、普通pcr筛选结果
[0063]
实验结果如图1所示，结果显示，使用引物对1、引物对2、引物对3和引物对4对实验样本进行pcr，都能获得阳性条带，但在使用上述4对引物对阴性对照进行pcr时，引物对1、引物对2和引物对3也有杂带出现，说明上述3对引物并非针对嗜酸乳杆菌的特异性引物，且引物对3在以阳性对照质粒dna为模板进行pcr时，无法获得阳性条带。引物对4在以植物乳杆菌wcsf1基因组dna为模板时不会获得杂带，且在以实验样本为模板时能获得清晰的阳性条带，因此，经过筛选，认为引物对4为特异性引物。
[0064]
5、使用荧光定量pcr的方法筛选特异性引物
[0065]
以植物乳杆wcsf1基因组dna作为阴性对照，以嗜酸乳杆菌基因组dna为实验组样本，分别以引物对1、引物对2，引物对3和引物对4进行qpcr实验，以筛选针对嗜酸乳杆菌的特异性引物。
[0066]
6、荧光定量pcr筛选结果
[0067]
实验结果如图2所示，结果显示，使用引物对1、引物对2、引物对3和引物对4对实验样本进行qpcr，都能获得扩增曲线，但在使用上述4对引物对阴性对照进行qpcr时，引物对1、引物对2和引物对3也有扩增曲线出现，说明上述3对引物并非针对嗜酸乳杆菌的特异性引物。引物对4在以植物乳杆菌wcsf1基因组dna为模板时没有扩增曲线，且在以实验样本为模板时有扩增曲线，且溶解曲线为单一峰。
[0068]
综上，经过筛选确认引物对4为特异性引物。
[0069]
实施例2嗜酸乳杆菌特异性引物的灵敏度检测
[0070]
1、灵敏度实验设计
[0071]
为了验证上述特异性引物的灵敏度，在实验样本嗜酸乳杆菌的基因组dna(dna浓度为1ng/μl)中，分别以1∶1、1∶10和1∶100的比例在待测样本中混入植物乳杆菌cect7527、植物乳杆菌cect7528和植物乳杆菌cect7529的基因组dna混合样本(dna浓度为1ng/μl)，待测样本浓度被稀释为0.5ng/μl、0.1ng/μl、0.01ng/μl，然后使用特异性引物对进行pcr与荧光定量pcr。如果即使混入大量冗余基因组dna样本，目标基因组仍能被检出，说明特异性引物同时具有高灵敏度。
[0072]
2、实验结果
[0073]
以不同比例混入冗余dna的嗜酸乳杆菌基因组dna样本的pcr检测结果如图3所示，分别在以1∶1、1∶10和1∶100的比例混入植物乳杆菌cect7527、植物乳杆菌cect7528和植物乳杆菌cect7529的冗余基因组dna混合样本后，待测样本浓度被稀释为0.5ng/μl、0.1ng/μl、0.01ng/μl，都能检测到阳性条带，且阳性条带清晰可见。
[0074]
以不同比例混入冗余dna的嗜酸乳杆菌基因组dna样本的qpcr检测结果如图4所示，结果显示，3个混合样本均能检出嗜酸乳杆菌，且溶解曲线出峰单一，既证明了引物的灵敏度，也反映了引物的特异性。
[0075]
实施例3嗜酸乳杆菌特异性引物使用普通pcr与荧光定量pcr的高灵敏度检测
[0076]
1、重组质粒la-pmd18-t/dh5a的构建：重组质粒委托江苏金唯智生物科技有限公司构建。质粒序列见seq id no：3所示。
[0077]
2、绝对荧光定量pcr标准曲线的建立：
[0078]
以质粒la-pmd18-t/dh5α为阳性标准品，以10倍比连续稀释6个稀释倍数作为模板进行荧光定量pcr反应。反应体系包括：dna模板(20.4ng/μl)2μl，引物对4(10μmol/l)正反向引物各0.4μl，2
×
sybrgreenmastermix10μl，bsa(20mg/μl)0.2μl，ddh2o7μl；
[0079]
反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，51℃退火30s，72℃延伸30s，反应程序共40个循环；熔解曲线程序：95℃，1min；51℃，30s；95℃，30s。
[0080]
标准品浓度按以下公式折算为拷贝数：以标准品拷贝数的对数值为横坐标ct值为纵坐标进行线性拟合并绘制标准曲线，得到的线性方程为：y＝-3.468x+37.733(r2＝0.998)(参见图5)。
[0081]
3、待测样品嗜酸乳杆菌片总dna的提取：
[0082]
样品预处理：称取待测样品0.5g置于装有4.5ml生理盐水的无菌摇菌管中，在4℃条件下100rpm震荡1h，制成1∶10的样品均液，对均液进行10倍梯度稀释。选择10-2
浓度的菌液进行样品细菌基因组dna的提取。
[0083]
样品细菌基因组dna提取方法：同实施例1步骤2。
[0084]
4、待测样品的嗜酸乳杆菌定量检测：
[0085]
以待测样品总dna为模板进行荧光定量pcr扩增，反应体系及程序同步骤2(结果参见图6)。将得到的ct值17.896代入步骤5建立的线性方程，从而获得1g样品中基因拷贝数为3.74
×
109个。
[0086]
5、普通pcr与荧光定量pcr的高灵敏度检测
[0087]
普通pcr扩增：分别将浓度为100ng/μl的嗜酸乳杆菌基因组dna以10倍系列梯度稀
释，取每个稀释度的1μldna溶液为模板，用引物la129和la428，以上述普通pcr扩增的反应体系及扩增程序进行pcr，用琼脂糖凝胶电泳检测pcr产物(300bp)，结果参见图7，显示可检测dna的最低浓度为100pg/μl。
[0088]
绝对荧光定量pcr：分别将浓度为100ng/μl的嗜酸乳杆菌基因组dna以10倍系列稀释，取每个稀释度的1μldna溶液为模板，用引物la129和la428，将绝对荧光定量pcr扩增的反应体系及扩增程序进行普通pcr和荧光定量pcr，结果参见图8，扩增阳性的最低浓度为100fg/μl，比普通pcr检测dna的灵敏度高1000倍。