一种核酸清除剂、其制备方法及其应用与流程

1.本发明涉及清除核酸污染技术领域，尤其涉及一种核酸清除剂、其制备方法及其应用。


背景技术：

2.核酸是生物聚合物脱氧核糖核酸和核糖核酸的总称，存在于目前已知的所有生命形式中。不同生物的特异核酸序列不同，通过聚合酶链式反应(pcr)检测特异核酸序列被广泛应用于体外诊断、动植物商品检疫、法医鉴定等领域。然而pcr操作过程中易受到核酸污染导致的假阳性结果，严重影响了检测准确性。因此需要开发一种清除核酸污染的方案以保障检测结果的可靠性。传统的清除环境和设备核酸污染的方法中主要有采用酒精或84消毒液作为核酸清除剂进行擦拭，或采用紫外灯进行照射消毒。但酒精和84消毒液清除核酸污染的能力相对较弱，且84消毒液属含氯消毒液，对人和动物有一定的毒性，对皮肤、金属及带色纺织物具有较强的腐蚀和脱色作用。采用紫外灯照射杀菌费时费力，且紫外照射的作用原理是使pcr产物中嘧啶碱基形成二聚体，使得延伸终止，该方案仅对500bp以上长片段有效，对短片段效果不大。
3.现上市可降解短链核酸分子的核酸清除剂有酶降解型核酸清除剂，例如在中国专利文献上公开的公告号为cn115181616a的“一种基于病毒阻断剂的核酸清除剂及其用途”，其组分包括：病毒阻断蛋白、核酸酶；任选的稳定剂；任选的溶剂；所述重组融合蛋白为病毒阻断剂且包含冠状病毒s棘突蛋白特异结合的结构域。这类核酸清除剂在通过核酸酶降解核酸的同时可能会带来蛋白质污染，还有一些为非喷雾型核酸清除剂，这类核酸清除剂通过悬液法降解核酸分子，对气溶胶核酸分子的消除效果不详。为了核酸检测的准确性和实验人员的安全，有必要发明一种无毒害、无腐蚀性且高效广谱的核酸清除剂。


技术实现要素：

4.本发明为了克服现有技术下核酸清除剂会腐蚀金属并对人体有一定毒害作用，且无针对气溶胶核酸分子消除的产品的问题，提供了一种核酸清除剂。该核酸清除剂既可用于悬液法清除核酸分子，又可用于气溶胶法清除核酸分子。组成成分中的过氧化物含量不高且不含含氯化合物，对金属表面不会造成腐蚀，对人体无毒害作用；对核酸分子进行非特异性破坏，具有广谱性。本发明还提供了一种核酸清除剂的制备方法以及该核酸清除剂的应用。
5.为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：一种核酸清除剂，包括a液和b液，a液包括如下质量分数的组分：3％-7.5％过氧化氢、5％-10％无水乙醇，余量为水；b液的ph为9-12，包括如下组分：10-100mmol/l 4-羟乙基哌嗪乙磺酸、2-10mmol/l金属离子盐、0.001％-0.002％质量分数的表面活性剂、碱和水。
6.a液中的过氧化氢和无水乙醇作为核酸清除剂中的失活剂，过氧化氢产生氢氧自
由基令核酸分子失活，乙醇能使核酸链断裂。b液中金属离子盐提供的金属离子可催化过氧化氢产生氢氧自由基，4-羟乙基哌嗪乙磺酸在过氧化氢和金属离子作用过程中起辅助作用，可令核酸分子进一步失活，两者的作用使得a液中过氧化氢的浓度在较低的情况下有良好的核酸清除效果，进而避免由于使用较高浓度的过氧化氢对人体产生的毒害作用。4-羟乙基哌嗪乙磺酸在碱性溶液中溶解度较高，并且对过氧化氢和金属离子的辅助效果较好，因此b液中还需要使用碱调节b液ph，同时b液在该ph下与a液混合后总体仍呈碱性，且不会腐蚀金属。表面活性剂可提高核酸清除剂对被污染物中待清除核酸的润湿效果，进而提高核酸清除剂对核酸的分解速率。
7.作为优选，所述金属离子盐为水溶性铜盐、水溶性锌盐和水溶性亚铁盐中的一种或几种。
8.cu
2+
、zn
2+
和fe
2+
可有效催化过氧化氢分解。
9.作为优选，所述金属离子盐为硫酸铜、硝酸铜、硫酸锌、硝酸锌和硫酸亚铁的一种或几种。
10.作为优选，所述碱为氢氧化钠和氢氧化钾中的一种或几种。
11.作为优选，所述表面活性剂为耐碱性表面活性剂。
12.耐碱性表面活性剂如十二烷基硫酸钠、脂肪醇醚磺酸盐和脂肪醇醚羧酸盐，可在碱性体系中起到良好的改善核酸清除剂的渗透和润湿效果的作用。
13.作为更优选，所述表面活性剂为十二烷基硫酸钠。
14.一种核酸清除剂的制备方法，包括如下步骤：(1)将过氧化氢和无水乙醇混合后加入水，混合均匀得到a液；(2)将4-羟乙基哌嗪乙磺酸溶于水中，加入碱调节ph至9-12，再依次加入金属离子盐和表面活性剂，混合均匀得到b液。
15.作为优选，所述步骤(2)为将4-羟乙基哌嗪乙磺酸溶于水中，加入含碱的水溶液调节ph至9-12，含碱的水溶液中碱浓度为0.1-1mol/l。
16.核酸清除剂在悬液法清除核酸污染中应用，包括如下步骤：将核酸清除剂a液、b液以(1-1.5)：1的体积比混合，将被污染的器材浸入混合液中10-20min，再清洗器材表面以除去核酸清除剂。
17.本发明可用于悬液法清除核酸污染，核酸清除剂a液和b液的混合液可破坏浸泡于其中的器材上的污染核酸，且清除污染核酸的速度快，所需的浸泡时间短。浸泡后，器材表面残留未与核酸反应的失活剂，需清洗器材除去该部分失活剂，以避免器材再次用于检测核酸时残留的失活剂破坏待测核酸样品。
18.作为优选，所述步骤包括使用中和剂清洗器材表面，中和剂包括硫代硫酸钠。
19.硫代硫酸钠可与残留的过氧化氢反应，使核酸清除剂失活。
20.作为更优选，所述中和剂为包含如下质量分数组分的胰蛋白胨生理盐水溶液：1.5-2％硫代硫酸钠、0.4-0.5％卵磷脂、0.4-0.5％吐温-80。
21.核酸清除剂在清除气溶胶的核酸污染中应用，包括如下步骤：将核酸清除剂b液喷洒于空气中，待b液喷洒完毕再将核酸清除剂a液喷洒于空气中，a液喷洒完毕后静置，静置时间大于1h。
22.本发明还可用于气溶胶中核酸的清除，使用时依次喷洒b液和a液，去除效果好。
23.作为优选，述步骤中以空气体积计，b液的喷洒量为(8-15)ml/m3，a液的喷洒量为(8-15)ml/m3。
24.作为优选，所述a液喷洒完毕后静置后，重复喷洒b液和a液2-3次。
25.若气溶胶中核酸污染严重，可重复喷洒2-3次以提高清除效果。
26.因此，本发明具有如下有益效果：(1)可对核酸分子进行非特异性破坏，具有广谱性，清除效率高；(2)核酸清除剂中的过氧化物含量不高且不含含氯化合物，不会腐蚀金属表面从而对仪器造成损害，并且对人体无毒害作用；(3)该核酸清除剂既可用于悬液法清除核酸，也可用于清除气溶胶中的核酸。
具体实施方式
27.下面结合具体实施方法对本发明做进一步的描述。
28.实施例1一种核酸清除剂，由如下步骤制备得到：(1)将过氧化氢和无水乙醇加入烧杯中混合后，再加入纯化水稀释并搅拌均匀得到a液，a液中过氧化氢的质量分数为3％，无水乙醇的质量分数为5％；(2)向烧杯中加入4-羟乙基哌嗪乙磺酸和纯化水，加入0.2mol/l的氢氧化钠溶液调节ph至10，再依次加入五水硫酸铜和十二烷基硫酸钠，混合均匀得到b液，b液中4-羟乙基哌嗪乙磺酸浓度为50mmol/l，硫酸铜浓度为2mmol/l，十二烷基硫酸钠的质量分数为0.001％。
29.实施例2一种核酸清除剂，其制备步骤与实施例1的不同之处在于，a液中过氧化氢的质量分数为6％，无水乙醇的质量分数为10％，b液中4-羟乙基哌嗪乙磺酸浓度为30mmol/l，硫酸铜浓度为4mmol/l，十二烷基硫酸钠的质量分数为0.0015％。
30.实施例3一种核酸清除剂，其制备步骤与实施例1的不同之处在于，b液中使用硫酸亚铁七水合物替换五水硫酸铜。
31.对比例1一种核酸清除剂，其制备步骤与实施例2的不同之处在于，步骤(2)中不加入氢氧化钠溶液。
32.对比例1所得b液中含有白色絮状物，这表明在不调节b液ph的情况下，4-羟乙基哌嗪乙磺酸无法溶于b液中，从而无法在使用时与金属离子和过氧化氢充分混合，进而实现其辅助金属离子催化过氧化氢产生自由基的技术效果。
33.对比例2一种核酸清除剂，其制备步骤与实施例2的不同之处在于，步骤(2)中向烧杯中加入纯化水，加入0.1mol/l的氢氧化钠溶液调节ph至10，再依次加入五水硫酸铜和十二烷基硫酸钠，混合均匀得到b液，b液中硫酸铜浓度为4mmol/l，十二烷基硫酸钠的质量分数为0.0015％。
34.实施例4核酸清除剂在悬液法清除核酸污染中应用，步骤如下：
(1)配制含2％硫代硫酸钠、0.5％卵磷脂、0.5％吐温-80的胰蛋白胨生理盐水溶液(tps)作为中和剂；(2)分别将实施例1所得的a液和b液以1：1的体积比混合得到混合液；(3)取5组反应管记为
①
组、
②
组、
③
组、阳性对照组和阴性对照组，其中
①
组反应管中加入1ml核酸质控品、2ml核酸清除剂和2ml去离子水，
②
组反应管中加入1ml核酸质控品、2ml核酸清除剂和2ml中和剂，
③
组反应管中加入1ml核酸质控品、2ml去离子水和2ml中和剂，阳性对照组反应管中加入1ml核酸质控品和4ml去离子水，阴性对照组加入5ml去离子水；(4)各组反应管中组分混合反应10min后取样进行荧光定量pcr检测，荧光定量pcr扩增体系如表1所示，仪器设置参数如表2所示。
35.表1.荧光定量pcr扩增体系表1.荧光定量pcr扩增体系
36.表2.荧光定量pcr扩增反应条件
37.检测结果如表3所示。
38.表3.实施例1检测结果
39.由表3可知，本发明可有效快速清除核酸。
③
组的ct值与阳性对照相近，这表明中和剂不影响核酸检出，而
②
组的ct值相较于阳性对照升高了8-11，但低于
①
组，这表明中和剂具有中和体系中的强氧化剂的效果。
40.再分别将实施例2-3和对比例2所得的a液和b液以1：1的体积比混合，取0.9ml混合后的核酸去除剂与0.1ml核酸质控品混合20min，取样进行荧光定量pcr检测，荧光定量pcr扩增体系如表1所示，仪器设置参数如表2所示，检测结果如表4所示。
41.表4.实施例2-3和对比例1-2检测结果2检测结果
42.由表4可知，实施例2-3所制得的核酸清除剂均在与核酸混合20min时有效分解了核酸，对比例1和对比例2的清除效果弱于实施例2，这表明4-羟乙基哌嗪乙磺酸可在过氧化氢和金属离子作用过程中起辅助作用。
43.实施例5一种核酸清除剂，其制备步骤与实施例1的不同之处在于，a液中过氧化氢的质量分数为7.5％，无水乙醇的质量分数为10％，b液中4-羟乙基哌嗪乙磺酸浓度为100mmol/l，硫酸铜浓度为4mmol/l，十二烷基硫酸钠的质量分数为0.001％。
44.实施例6核酸清除剂在清除气溶胶的核酸污染中应用，步骤如下：(1)将小鼠肝炎病毒核酸置于荧光定量pcr仪中扩增；(2)将扩增好的核酸产物取50ul加入50ml去离子水中，放入喷壶中，均匀喷洒于高2.72米，长7.7米，宽6.08米实验室内，关闭门窗；(3)用一次性采样棉签随机取10个点采集样本(a01-a05为物表，a06-a10为培养皿自然沉降)，每个样本棉签加入到1ml去离子水中浸泡60s后取出棉签作为模板，按荧光定量pcr扩增体系进行检测；(4)将实施例5制得的核酸清除剂b液以10 ml/m3的形式喷洒于实验室中，待b液喷洒完毕再将核酸清除剂a液以10 ml/m3的形式对实验室进行全面喷洒；(5)分别在a液喷洒完毕后静置1h和2h时，用一次性采样棉签如步骤(3)所述采样方式采样并检测。
45.荧光定量pcr扩增体系如表5，荧光定量pcr仪扩增反应条件如表6，检测结果如表7。
46.表5.荧光定量pcr扩增体系表5.荧光定量pcr扩增体系
47.表6.荧光定量pcr扩增反应条件
48.表7.检测结果
49.由表7可知，经核酸清除剂处理1h后的气溶胶的ct值较清除前ct值的升高了6以上，这说明原气溶胶中核酸数量是经实施例5制得的核酸清除剂降解后的气溶胶中核酸数量的104倍，实施例5制得的核酸清除剂具有清除气溶胶中核酸的效果。