一种新的色氨酸脱羧酶突变体、重组基因工程菌的构建及其应用的制作方法

本发明属于生物，尤其涉及一种新的色氨酸脱羧酶突变体、重组基因工程菌的构建及其应用。

背景技术：

1、色胺及5-羟基色胺均属于色氨酸衍生物，与色氨酸结构类似。色胺存在于哺乳动物大脑中，具有潜在的神经调节功能。作为一种重要的中间产物，色胺可进一步合成多种萜类吲哚生物碱，如长春胺、长春西汀和异胡豆苷等，在医药与化工领域具有重要价值。

2、5-羟基色胺最早从血清中发现，又名血清素。其广泛存在于哺乳动物组织中，且主要分布于松果体和下丘脑，能够调节多种生理功能，如睡眠、食欲、情绪、免疫调节和痛觉感知等。此外，5-羟基色胺在植物中也发挥重要功能，包括开花周期、形态建成、衰老、抵御生物胁迫等生理调节过程。

3、5-羟基色胺可通过化学合成或从动植物中提取获得，色胺主要依赖化学、生物合成。化学合成涉及众多有毒有害试剂，且工艺流程长、使用原料种类多、条件苛刻和三废多。南京法恩化学有限公司在其专利cn112300049b中利用5-羟基吲哚、硝基乙烯经过多步化学反应生产5-羟基色胺，收率高达91％，但需要多种有机溶剂、反应条件严苛。吴静等人利用化学脱羧法合成色胺，其收率达99.4％，但反应需在120℃高温下进行，且使用的二苯醚属于有毒有害试剂。动植物提取技术尚不成熟，且产量低、纯度低。而生物合成属于绿色合成工艺，具有三废少且易处理，可规模化、性价比高等特点，应用前景广阔。新泰市佳禾生物科技有限公司在其专利cn113403351a中使用酶法催化l-色胺酸形成色胺及d-色氨酸，转化率达98.9％，但生产过程较为复杂，如粗酶液获取需经高压均质处理、反应前需对底物消旋反应等，额外增加了生产成本。

4、本发明从提升脱羧酶活性和简化生产工艺两方面出发，探究色胺及5-羟基色胺的工业化生产条件，降低了生产成本，提高了合成效率。

技术实现思路

1、为了解决以上技术问题，本发明提供了一种新的色氨酸脱羧酶(l-tryptophandecarboxylase，tdc)突变体、重组基因工程菌的构建及其应用。

2、为了解决上述技术问题，本发明采用了以下技术方案：

3、第一方面，本发明提供一种色氨酸脱羧酶突变体，

4、(a)其氨基酸序列由seq id no:1所示序列突变而来，在选自下组的一个或多个氨基酸残基位点发生突变：37位、73位、91位、187位、352位和432位，即37位、73位、91位、187位、352位和432位突变可以选自除原本氨基酸外的其他氨基酸中的任意一种；

5、或(b)所述色氨酸脱羧酶与(a)所述的氨基酸序列相似性达95％以上，优选98％以上，更优选99％以上，并且具有(a)所述蛋白的功能，其中对应于seq id no:1所示氨基酸序列的37位、73位、91位、187位、352位和/或432位氨基残基与(a)所述的氨基酸序列突变方式相同；

6、或(c)所述色氨酸脱羧酶由在(a)所述的氨基酸序列的c末端和/或n末端添加或缺失1-20个，优选1-10个，更优选1-5个的氨基酸残基而形成，并且具有(a)所述蛋白的功能，其中对应于seq id no:1所示氨基酸序列的37位、73位、91位、187位、352位和/或432位氨基残基与(a)所述的氨基酸序列突变方式相同。

7、优选地，37位的突变是突变为脯氨酸、丝氨酸或天冬氨酸，73位的突变是突变为异亮氨酸或亮氨酸，91位的突变是突变为丙氨酸或苏氨酸，187位的突变是突变为缬氨酸、甲硫氨酸或亮氨酸，352位的突变是突变为赖氨酸、半胱氨酸、丙氨酸或天冬氨酸，432位的突变是突变为亮氨酸或缬氨酸。

8、更优选地，37位的突变为脯氨酸，73位的突变为异亮氨酸，91位的突变为丙氨酸，187位的突变为缬氨酸，352位的突变为赖氨酸，432位的突变为亮氨酸。

9、第二方面，本发明还提供一种编码上述色氨酸脱羧酶突变体的基因。

10、第三方面，本发明提供一种表达载体，所述表达载体包含编码上述色氨酸脱羧酶突变体的基因，能够表达上述色氨酸脱羧酶突变体。

11、第四方面，本发明提供一种重组基因工程菌，所述重组基因工程菌中包含上述表达载体或其基因组中整合有编码色氨酸脱羧酶突变体的基因。所述重组基因工程菌可将上述表达载体转入宿主细胞中获取。

12、在具体的实施方式中，所述宿主细胞是细菌或酵母菌；优选地，所述宿主细胞是大肠杆菌(e.coli)、谷氨酸棒杆菌(corynebacterium glutamicum)、枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)、酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)、毕赤酵母(pichia pastoris)和解脂耶氏酵母(yarrowia lipolytica)；更优选地，所述宿主细胞是大肠杆菌、酿酒酵母；最优选地，所述宿主细胞是大肠杆菌。

13、第五方面，本发明提供上述色氨酸脱羧酶突变体或表达载体或基因工程菌在生产色胺或5-羟基色胺中的应用。

14、第六方面，本发明还提供一种生产色胺或5-羟基色胺的方法，包括以下步骤：将基因工程菌诱导蛋白表达，然后离心收集细胞，后处理，再加入到含有原料色氨酸或5-羟基色氨酸的转化液中反应，最后从转化液中分离得到色胺或5羟基色胺。

15、进一步地，所述的后处理为用0.9％生理盐水洗涤。

16、按上述方案，所述转化液为含30～200g/l的色氨酸或5-羟基色氨酸、0.2～0.5g/l的磷酸吡哆醛的水溶液。

17、按上述方案，所述反应温度为30～40℃。

18、按上述方案，所述反应过程为摇床震荡，转速为100～300rpm。

19、按上述方案，所述反应时间为3～24h。

20、按上述方案，所述的反应体系为密闭条件。

21、与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

22、本发明通过对seq id no:1所示色氨酸脱羧酶原始序列进行突变，获得了活性明显提升的色氨酸脱羧酶突变体。其用于生成色胺和5-羟基色胺，可显著提升催化效率，降低催化过程微生物细胞用量，降低生产成本，其催化产率较野生型酶最高分别可提升584％、225％，色胺和5-羟基色胺的产量分别高达52g/l、79g/l。

23、初始反应体系为水，除底物色氨酸或5羟基色氨酸、辅酶磷酸吡哆醛外，不添加任何其它物质，所得产物无杂质，便于分离。

技术特征：

1.色氨酸脱羧酶突变体，其特征在于，

2.根据权利要求1所述的色氨酸脱羧酶突变体，其特征在于，37位的突变是突变为脯氨酸、丝氨酸或天冬氨酸，73位的突变是突变为异亮氨酸或亮氨酸，91位的突变是突变为丙氨酸或苏氨酸，187位的突变是突变为缬氨酸、甲硫氨酸或亮氨酸，352位的突变是突变为赖氨酸、半胱氨酸、丙氨酸或天冬氨酸，432位的突变是突变为亮氨酸或缬氨酸。

3.根据权利要求2所述的色氨酸脱羧酶突变体，其特征在于，37位的突变为脯氨酸，73位突变为异亮氨酸，91位突变为丙氨酸，187位突变为缬氨酸，352位突变为赖氨酸，432位突变为亮氨酸。

4.一种编码权利要求1所述的色氨酸脱羧酶突变体的基因。

5.一种表达载体，其特征在于，包含编码权利要求4所述的色氨酸脱羧酶突变体的基因，能够表达权利要求1所述的色氨酸脱羧酶突变体。

6.一种重组基因工程菌，其特征在于，所述重组基因工程菌中包含权利要求5所述的表达载体或其基因组中整合有权利要求4所述的编码色氨酸脱羧酶突变体的基因。

7.根据权利要求6所述的重组基因工程菌，所述重组基因工程菌将权利要求5所述的表达载体转入宿主细胞中获取，所述宿主细胞是细菌或酵母菌。

8.权利要求1所述的色氨酸脱羧酶突变体或权利要求5所述的表达载体或权利要求6所述的重组基因工程菌在生产色胺或5-羟基色胺中的应用。

9.一种生产色胺或5-羟基色胺的方法，其特征在于：包括以下步骤：将权利要求6所述的重组基因工程菌诱导蛋白表达，然后离心收集细胞，后处理，再加入到含有原料色氨酸或5-羟基色氨酸的转化液中反应，最后从转化液中分离得到色胺或5羟基色胺。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述转化液为含30～200g/l的色氨酸或5-羟基色氨酸、0.2～0.5g/l的磷酸吡哆醛的水溶液；

技术总结
本发明公开了一种新的色氨酸脱羧酶突变体、重组基因工程菌的构建及其应用。通过对色氨酸脱羧酶原始序列进行突变，使得突变后的色氨酸脱羧酶活性提升，其表现为催化色氨酸产色胺、以及催化5‑羟基色氨酸产5‑羟基色胺水平显著提高。本发明还提供了表达色氨酸脱羧酶突变体的表达载体以及大肠杆菌工程菌的构建方法。使用表达色氨酸脱羧酶突变体的工程菌可显著提升催化效率，为色胺及5‑羟基色胺工业化生产奠定基础。

技术研发人员：吴元庆,杨志彬,胡江林,冯斌
受保护的技术使用者：河北维达康生物科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/12