一种柯萨奇病毒A10单克隆抗体及应用的制作方法

本申请涉及抗体领域，特别是涉及一种柯萨奇病毒a10单克隆抗体及应用。

背景技术：

1、手足口病(hand foot mouth disease，hfmd)是由不同的肠道病毒所引起的婴幼儿常见的传染病，其临床症状常见手、足、口部皮疹、疱疹；大部分手足口病病情较轻且具有自限性，但少部分患者病情进展迅速，伴有严重的中枢神经系统疾病并发症，导致患者死于心肺衰竭鉴于hfmd传播范围广且危害较大，对儿童生命健康造成严重威胁，我国于2008年将其列为丙类传染病。手足口病的致病病原体为肠道病毒a型(enterovirus a,ev a)，主要包括肠道病毒71型(enterovirus a71,ev a71)柯萨奇病毒(coxsackievirus,cv)(cv a16、cv a6和cv a10)，其中ev a71和cv a16是引起hfmd的主要致病病原体。然而近年来研究表明，cv a10和cv a6感染所导致的手足口病病例呈现上升的趋势，cv a10正逐渐转变为我国部分地区hfmd的优势病原。

2、不同病毒感染引起的手足口病临床表现也略有差异。cv a10感染后，一般只引起轻度和自限性疾病症状，如发烧、口腔溃疡、手脚上的皮疹或水疱疹等，也会发生如指甲脱落、疱疹性咽峡炎、神经脊髓炎、脑膜炎等严重的手足口病并发症，或者出现死亡。目前，我国自主研发的单价ev a71灭活疫苗已上市，但其不能预防cv a10等其他型别肠道病毒引起的hfmd。针对cv a10没有上市的预防性疫苗和特效的治疗性药物，因此，制备高效、价廉、副反应小的被动免疫制剂成为研究的热点。单克隆抗体的体外抗病毒中和活性和体内保护肌体抵抗病毒攻击已获得许多实验证明其可在体内保护动物免受病毒攻击，中和抗体药物可以预防和治疗病毒感染。这为推动我国手足口病病毒所致的重症与死亡病例的治疗与研究有重要意义，对进一步推进的临床研究、流行病学发展以及被动治疗具有极其重要的价值。

技术实现思路

1、鉴于以上所述现有技术的缺点，本研究以cv a10 vlp作为免疫原制备了能特异性识别cv a10的中和性单克隆抗体。通过elisa、sds-page、western blot以及中和实验等方法说明10h11单抗可用于灵敏检测和分析cv a10，且具有较强的中和活性，可在病毒感染的诊断和疫苗开发的研究中存在巨大潜力。

2、为实现上述目的及其他相关目的，本申请第一方面提供一种柯萨奇病毒a10单克隆抗体，所述a10单克隆抗体包括如下技术特征中的一个或多个：

3、重链可变区包括氨基酸序列如seq id no:1所示的cdr-h1：gftfteys；

4、重链可变区包括氨基酸序列如seq id no:2所示的cdr-h2：irnkangyrt；

5、重链可变区包括氨基酸序列如seq id no:3所示的cdr-h3：areisgihyfgygfay；

6、轻链可变区包括氨基酸序列如seq id no:4所示的cdr-l1：qtivhssgnty；

7、轻链可变区包括氨基酸序列如seq id no:5所示的cdr-l2：rvs；

8、轻链可变区包括氨基酸序列如seq id no:6所示的cdr-l3：fqgshvpwt。

9、在本申请的任意实施方式中，所述重链可变区和所述轻链可变区还包括框架区fr1-fr4。

10、在本申请的任意实施方式中，所述重链可变区的fr1的氨基酸序列包括seq idno:7所示的序列：evklvesggglvqpggslrlsctts；

11、所述重链可变区的fr2的氨基酸序列包括seq id no:8所示的序列：mswvrqppgkalewlgf；

12、所述重链可变区的fr3的氨基酸序列包括seq id no:9所示的序列：eynpsmegrftisrdnsqstlylqmntlstedsatyyc；

13、所述重链可变区的fr4的氨基酸序列包括seq id no:10所示的序列：wgqgtlvtvsa。

14、在本申请的任意实施方式中，所述轻链可变区的fr1的氨基酸序列包括seq idno:11所示的序列：dvlmtqtplslpvslgdqasiscrss；

15、所述轻链可变区的fr2的氨基酸序列包括seq id no:12所示的序列：lewylqkpgqspkvliy；

16、所述轻链可变区的fr3的氨基酸序列包括seq id no:13所示的序列：nrfsgvpdrfsgsgsgtdftlkisrveaedlgvyyc；

17、所述轻链可变区的fr4的氨基酸序列包括seq id no:14所示的序列：fgggtkleik。

18、在本申请的任意实施方式中，所述重链还包括信号肽；所述重链信号肽包括seqidno:15所示的氨基酸序列：mklwlnwiflvtllngiqc。

19、在本申请的任意实施方式中，所述轻链还包括信号肽；所述轻链信号肽包括seqidno:16所示的氨基酸序列：mklpvrllvlmfwipasss。

20、在本申请的任意实施方式中，所述重链的氨基酸序列包括seq id no:17所示的序列；

21、和/或，所述轻链的氨基酸序列包括seq id no:18所示的序列。

22、本申请第二方面提供一种核苷酸分子，编码所述的单克隆抗体。

23、本申请第三方面提供一种构建体，含有所述的核苷酸分子。

24、本申请第四方面提供一种表达系统，含有所述的构建体或基因组中整合有所述的核苷酸分子。

25、本申请第五方面提供所述的单克隆抗体或所述的核苷酸分子或所述的构建体或所述的表达系统在制备病毒检测产品、制备预防或治疗病毒感染产品、或用于病毒疫苗筛选与检测或疫苗活性评价中的用途。

26、在本申请的任意实施方式中，所述病毒为肠道病毒，优选为，柯萨奇病毒a10；更优选的，所述单克隆抗体用于制备手足口病检测产品、制备预防或治疗手足口病产品、或用于手足口病疫苗筛选及疫苗抗原定性定量的检测检定或疫苗活性评价的抗体参比品。

27、与现有技术相比，本申请的有益效果为：

28、1、本申请提供的单克隆抗体可特异性识别a10病毒样颗粒，但不能识别变性后的病毒样颗粒，提示单克隆抗体识别的表位可能是构象表位。

29、2、本申请提供的单克隆抗体对a10病毒样颗粒最低检测限度为15.625ng，是强有效的检测用工具。

30、3、本申请提供的单克隆抗体中和浓度为3.12μg/ml，显示了强大的中和活性，可用于cv a10的抗病毒药物开发，同时可在a10感染的临床诊断中作为高效灵敏的检测试剂，也可作为疫苗活性评价的抗体参比品。

技术特征：

1.一种柯萨奇病毒a10单克隆抗体，所述a10单克隆抗体包括如下技术特征中的一个或多个：

2.如权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述重链可变区和所述轻链可变区还包括框架区fr1-fr4。

3.如权利要求2所述的单克隆抗体，其特征在于，

4.如权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述重链还包括信号肽；所述重链信号肽包括seq id no:15所示的氨基酸序列：mklwlnwiflvtllngiqc；

5.如权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述重链的氨基酸序列包括seqidno:17所示的序列；

6.一种核苷酸分子，编码如权利要求1～5任一项权利要求所述的单克隆抗体。

7.一种构建体，含有如权利要求6所述的核苷酸分子。

8.一种表达系统，含有如权利要求7所述的构建体或基因组中整合有外源的如权利要求6所述的核苷酸分子。

9.如权利要求1～5任一项所述的单克隆抗体或如权利要求6所述的核苷酸分子或如权利要求7所述的构建体或如权利要求8所述的表达系统在制备病毒检测产品、制备预防或治疗病毒感染产品、用于病毒疫苗筛选与检测或疫苗活性评价中的用途。

10.如权利要求9所述的用途，所述病毒为肠道病毒，优选为，柯萨奇病毒a10；更优选的，所述单克隆抗体用于制备手足口病检测产品、制备预防或治疗手足口病产品、或用于手足口病疫苗筛选及疫苗抗原定性定量的检测检定或疫苗活性评价的抗体参比品。

技术总结
本申请涉及抗体领域，特别是涉及一种柯萨奇病毒A10单克隆抗体及应用。所述A10单克隆抗体包括如下技术特征中的一个或多个：重链可变区包括氨基酸序列如SEQ ID No:1所示的CDR‑H1；重链可变区包括氨基酸序列如SEQ ID No:2所示的CDR‑H2；重链可变区包括氨基酸序列如SEQ ID No:3所示的CDR‑H3；轻链可变区包括氨基酸序列如SEQ ID No:4所示的CDR‑L1；轻链可变区包括氨基酸序列如SEQ ID No:5所示的CDR‑L2；轻链可变区包括氨基酸序列如SEQ ID No:6所示的CDR‑L3。经筛选检测，得到了一株能够特异结合A10且具有中和活性的单克隆抗体：10H11。10H11可用于CV A10的抗病毒药物开发，同时可在A10感染的临床诊断中作为高效灵敏的检测试剂，A10疫苗筛选及疫苗抗原定性定量的检测检定试剂，A10疫苗活性评价的抗体参比品。

技术研发人员：刘庆伟,王晓黎,阮丽珠,杨义,边金,张玺,程飞
受保护的技术使用者：华淞（上海）生物医药科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/11