脐带间充质干细胞、脐带间充质干细胞制剂及其应用的制作方法

1.本发明涉及细胞治疗技术领域，特别涉及一种脐带间充质干细胞；同时，本发明还涉及一种脐带间充质干细胞制剂及其应用。


背景技术：

2.精神分裂症(schizophrenia,sc)是一类病因复杂、表型异质性高的慢性致残性疾病。常有知觉、思维、情感和行为等方面的障碍，一般无意识及智能障碍。目前普遍认为精神分裂症在普通人群中的终生患病率为1％，大多预后不良，超过50％的患者存在长期的间歇性精神问题，约20％的患者有残留症状，并导致精神残疾。精神分裂症概念的提出至今已有100余年，然而精神分裂症的发病及病理机制仍不清楚。精神分裂症的发病特征包括阳性症状(妄想、幻觉、兴奋等)、阴性症状(情感迟钝、情感退缩、情感交流障碍等)和认知功能障碍。现有的抗精神病药物主要通过阻断多巴胺d2受体发挥作用，大多只能控制阳性症状，阴性症状和认知功能障碍改善仍是目前临床治疗的难题。
3.脐带间充质干细胞(uc-msc)，主要指从新生儿脐带组织中提取的一种叫做间充质干细胞的细胞。间充质干细胞是一种多能干细胞，在不同的诱导条件下，可分化为多种组织细胞，如肌腱、血管、神经、脂肪、骨骼等多种组织分化，使其成为再生医学、组织器官损伤退行性疾病治疗领域的研究热点。间充质干细胞临床应用方面包括：
①
在骨关节炎方面，可以改善膝关节炎的预后；
②
在心血管疾病方面，衍生的外泌体已被证明具有改善缺血损伤、促进血管生成和保护心脏作用；
③
在糖尿病方面，可抑制刺激淋巴细胞的功能和传授胰岛素生产细胞分化潜力设定的低免疫原性，从而提供一种1型糖尿病疗法等。对于间充质干细胞，目前也应用于精神分裂领域，具体应用如下。
4.wo2016135295a1涉及一种遗传修饰的间充质干细胞(msc)，所述干细胞包含外源核酸，所述外源核酸包含与启动子或启动子/增强子组合可操作连接的klotho编码区。其涉及所述msc用于治疗癌症、器官纤维化、肾功能衰竭、器官或器官系统的年龄相关变化、动脉硬化、神经变性疾病，例如阿尔茨海默病(ad)、多发性硬化症(ms)、亨廷顿病、肌萎缩侧索硬化症(als)、帕金森病和/或精神分裂症，脓毒症和自身免疫性疾病以及自身免疫性相关疾病。wo2016083458a1涉及由成纤维细胞产生的诱导性多能干细胞(ipsc)及其用途，所述成纤维细胞取自神经发育障碍导致智力残疾的受试者(id)，和/或属于自闭症谱系障碍(asd)的受试者，和/或精神分裂症障碍(sz)的受试者。其还涉及由ipsc或ipsc系产生的间充质干细胞系，包括皮质神经祖细胞或终末分化的皮质谷氨酸能或γ-氨基丁酸能神经元细胞或神经嵴干细胞系。其还涉及用于治疗和/或预防神经发育障碍导致智力残疾(id)，和/或属于自闭症谱系障碍(asd)，和/或精神分裂症障碍(sz)的化合物的方法，以及用于治疗此类障碍的lsd1抑制剂或hdac2抑制剂。
5.wo2016135295a1将间充质干细胞进行遗传修饰，后应用于多种疾病治疗。wo2016083458a1则是利用间充质干细胞的外泌物，来用于多种疾病治疗。两种方法虽然均为精神分裂症具有一定的积极效果，但是其对于精神分裂症的针对性不强，且也并未对阴
性症状和认知障碍有改善作用，依然无法解决目前临床治疗的难题：改善精神分裂症患者的阴性症状和认知功能障碍。


技术实现要素：

6.有鉴于此，本发明旨在提出一种脐带间充质干细胞，以改善精神分裂症患者的阴性症状和认知功能障碍。
7.为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：
8.一种脐带间充质干细胞，所述脐带间充质干细胞的制备方法包括下列步骤
9.s1：由脐带分离得到华通氏胶，将所述华通氏胶分割为组织块，后移至第一培养基中；定期更换一次培养基，至组织块周围长出间充质干细胞；
10.s2：对所述间充质干细胞进行消化处理，当所述间充质干细胞的汇合度达到至少80％时消化处理；离心，得到沉淀物；
11.s3：将所述沉淀物接种至第二培养基，当所述间充质干细胞的汇合度达到至少80％时，转移至冻存液进行冻存。
12.进一步的，所述第一培养基为原代培养基，和/或所述第二培养基为传代培养基。
13.进一步的，消化处理选用胰蛋白酶。
14.其次，本发明还提供了一种脐带间充质干细胞制剂，所述脐带间充质干细胞制剂的制备方法为：将前述冻存间充质干细胞进行37℃水浴复苏，后转移并添加生理盐水，离心；离心完成后，过滤，即得。
15.再次，本发明还提供了前述脐带间充质干细胞和脐带间充质干细胞制剂在制备治疗精神分裂症药品中的应用。
16.进一步的，所述精神分裂症包括认知障碍和/或阴性症状。
17.进一步的，所述精神分裂症包括突触损伤和/或神经元损伤。
18.进一步的，所述精神分裂症包括β-ngf、d2、iba1的mrna相对含量失调。
19.进一步的，所述应用的方法为静脉回输。
20.最后，本发明还提供了前述脐带间充质干细胞和脐带间充质干细胞制剂在精神分裂症诊断和/或精神分裂症药物疗效评估的应用。
21.相对于现有技术，本发明具有以下优势：
22.1、本发明提供的脐带间充质干细胞，是从新生儿脐带中提取间充质干细胞，该间充质干细胞具有强增殖能力与神经元细胞分化能力。同时，本发明提供的脐带间充质干细胞具有低免疫原性，且由于其归巢特性，会自动向受损组织部位迁移，在适宜的条件下能定向分化为神经元细胞和神经胶质细胞。
23.2、对于精神分裂症的认知功能障碍，本发明用高剂量脐带间充质干细胞进行静脉回输，后通过行为学分析治疗组仔鼠改善情况，结果表明，经过脐带间充质干细胞治疗的精神分裂症仔鼠恢复到正常活动能力，即本发明的脐带间充质干细胞能够改善患者的认知功能障碍。对于精神分裂症的阴性症状，本发明用高剂量脐带间充质干细胞进行静脉回输，后通过分子生物学检测小鼠海马区域、额叶区域、纹状体区域中各种蛋白含量的变化分析干细胞是否具有治疗精神分裂症的效果，结果表明，脐带间充质干细胞能明显调控精神分裂症子鼠中的β-ngf、d2、iba1三种mrna的相对含量，有效抑制炎症反应，改善脑部的微环境，
缩短疾病活动期；脐带间充质干细胞能修复精神分裂导致的突触损伤，从根源修复受损组织，减少精神状况反复发作；脐带间充质干细胞能使受损的神经元得到恢复，从根源修复受损组织，减少精神状况反复发作；三方面共同作用，明显改善精神分裂症的阴性症状。
24.3、本发明采用高剂量脐带间充质干细胞和低剂量脐带间充质干细胞进行对比，并通过分子生物学检测小鼠海马区域和额叶区域中各种蛋白含量的变化情况，找到合适的细胞数剂量，更有利于脐带间充质干细胞应用于制备治疗精神分裂症药品。
附图说明
25.为了更清楚地说明本发明实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图做简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。在附图中：
26.图1为实施例1中脐带间充质干细胞的细胞形态显微镜观察图；
27.图2为实施例2.1中正常细胞组仔鼠海马区和额叶区的mrna变化图；
28.图3为实施例2.2中高剂量正常细胞组和低剂量正常细胞组的msc细胞流式检测结果图；
29.图4为实施例2.2中高剂量正常细胞组仔鼠和低剂量正常细胞组仔鼠海马区和额叶区的mrna变化图；
30.图5为实施例3.1中动物模型的构建方法图；
31.图6为实施例3.1中il-6和tnf-α含量检测结果图；
32.图7为实施例3.1中仔鼠的行为学ppi检测结果图；
33.图8为实施例3.2中对照组、疾病组和治疗组仔鼠额叶区的mrna变化图；
34.图9为实施例3.2中对照组、疾病组和治疗组仔鼠的蛋白质免疫印迹电泳结果图；
35.图10为实施例3.2中对照组、疾病组和治疗组仔鼠的蛋白质免疫印迹分析结果图；
36.图11为实施例3.2中疾病组仔鼠的神经元信号图；
37.图12为实施例3.2中治疗组仔鼠的神经元信号图；
38.图13为实施例3.2中对照组、疾病组和治疗组仔鼠的行为学-旷场检测结果图；
39.图14为实施例3.2中对照组、疾病组和治疗组仔鼠的行为学-y-迷宫检测结果图。
具体实施方式
40.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
41.本发明中，sd大鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司，质量合格证号为11400700258932，许可证号为scxk(京)2018-0006。脐带来源于科研捐献样本。基础培养基购置biological industries israel beit haemekltd，货号：05-200-1a。血清替代物购自lonza公司，货号：15950-017。促细胞生长诱导剂购自齐一生物科技(上海)有限公司，货号：7198-10。冻存液购自德国wak chemie公司，货号：wak-dmso-70。
42.本发明中，β-ngf为神经生长因子，bdnf为脑源性神经营养因子，cd133为造血干细胞抗原，d2为多巴胺受体g蛋白偶联受体，iba1为17kda的ef手性蛋白。
43.下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。
44.实施例1本实施例涉及一种脐带间充质干细胞制剂及其制备方法。
45.步骤一，脐带间充质干细胞培养。从新生儿的脐带中去除静脉和动脉，分离得到华通氏胶，用剪刀将华通氏胶剪成1cm3的组织块，接种到培养瓶中培养；之后每隔3天更换培养基继续培养。其中，培养瓶中的培养基为原代培养基(原代培养基＝基础培养基+血清替代物+促细胞生长诱导剂，基础培养基与血清替代物的体积比为1：20～30，基础培养基与促细胞生长诱导剂的体积比为1：10～20)，可增加组织块的细胞爬出量。
46.步骤二，脐带间充质干细胞消化传代。培养大约7天左后，组织块周围长出贴壁的间充质干细胞。在显微镜下观察细胞，当细胞汇合度达到80％时进行消化传代。去除培养瓶中的培养基，用胰蛋白酶消化贴壁细胞。当细胞收缩变圆、大部分细胞脱落时终止消化。将培养瓶中的物质转移至离心管进行离心，离心过程参数可根据实际情况调整，至离心管底部能够看到完全成型的细胞沉淀物。
47.步骤三，脐带间充质干细胞继续培养。离心完成后，去除胰蛋白酶，将细胞沉淀物接种至175培养瓶中扩增。其中，175培养瓶中的培养基为传代培养基，即为完全培养基，是基础培养基和血清替代物配比而成。基础培养基与血清替代物的体积比为1：20～50。
48.步骤四，脐带间充质干细胞继续消化传代。在显微镜下观察细胞，当细胞汇合度达到80％时继续进行消化传代。用胰蛋白酶消化贴壁细胞，当细胞收缩变圆、大部分细胞脱落时终止消化。将培养瓶中的物质转移至离心管进行离心。离心完成后采用70μm细胞过滤网进行细胞过滤。
49.步骤五，脐带间充质干细胞检测。过滤完成后，分别进行取样计数及活率计算、流式检测、安全性检测和形态学表征。具体的，取样计数及活率采用台盼蓝指示活/死细胞比例，通过显微镜统计活细胞和死细胞的数量，结果为98.68％。流式检测采用流式细胞仪，对脐带间充质干细胞进行表面标记物检测，结果为：cd90：99.98％，cd105：98.73％，cd73：99.87％，cd34/cd45/cd19/cd11b/hla-dr：0.69％，结果表明，间充质干细胞均符合间充质干细胞表面标记物的标准(cd105不得低于95％；cd 73不得低于95％；cd 90不得低于95％；cd 45不得过2％；cd19不得过2％；hla-dr不得过2％；cd 34不得过2％；cd 11b不得过2％)，说明本发明提供的制备方法获得的脐带间充质干细胞具有很强的细胞干性。
50.安全性检测是对细胞的支原体、内毒素、无菌等进行检测。内毒素采用鲎试剂进行检测，支原体采用pcr法(聚合酶链式反应技术)检测，无菌是采用血培养和革兰氏检测法，结果均为阴性，符合标准。台盼蓝染色法检测细胞存活状况、流式细胞仪检测表面标记物以及安全性检测方法均为本领域常规技术手段，故此处不再赘述。于显微镜下观察脐带间充质干细胞的细胞形态，并采集图像(见图1)。由图1可知，细胞形态呈典型的脐带间充质干细胞形态，细胞生长状态良好，细胞排列致密，细胞形态为长梭形，边缘清楚。
51.步骤六，脐带间充质干细胞悬浮冻存。四项检测全部通过后，将过滤(70μm细胞过滤网)得到的细胞再次离心。离心完成后，用冻存液悬浮细胞，分装到冻存管中，通过程序降温盒过夜，然后转入液氮长期保存。
52.步骤七，制备uc-msc细胞悬液。将处于用冻存液悬浮状态的间充质干细胞进行复
苏，后制备为uc-msc细胞悬液，具体步骤为：把步骤六中的冻存脐带间充质干细胞在37℃下进行水浴复苏。复苏后的脐带间充质干细胞迅速转移到含有生理盐水的离心管中，进行离心，得到沉淀物。将沉淀物用70μm细胞滤网过滤。提前计算好仔鼠所需的细胞数量(如根据所述的细胞数量标准2*106/50g)，然后将过滤后的脐带间充质干细胞转移至2ml的冻存管中，每管0.5ml，uc-msc细胞悬液即得，此即为间充质干细胞细胞制剂。
53.实施例2本实施例涉及脐带间充质干细胞应用于正常sd大鼠。
54.实施例2.1本实施例探究脐带间充质干细胞对正常sd大鼠的生物效应。
55.步骤一，正常sd大鼠受孕后观察其状态直至分娩，从仔鼠出生第28天开始，对仔鼠给予静脉注射。根据仔鼠出生时间和数量，将正常sd大鼠的仔鼠随机分配为两组，一组为正常盐水组，另一组为正常细胞组。两组仔鼠的数量一致，均为4只。正常盐水组指的是对仔鼠给予尾静脉注射无菌生理盐水。正常细胞组指的是对仔鼠给予尾静脉注射uc-msc细胞悬液。
56.步骤二，本实施例的脐带间充质干细胞悬液，根据实施例1步骤六制得。具体到每只仔鼠的用量，则需要根据其体重计算。称取仔鼠重量，根据仔鼠重量制备uc-msc细胞悬液。本实施例所需细胞数量具体为2*106/50g。如其中一只仔鼠的重量为50g，则该只仔鼠需要的细胞数为2*106，由于实施例1已经进行过计数及活率，故仅需要根据计数及活率检测结果配制所需的细胞数即可，具体的uc-msc细胞悬液的制备方法与实例1中的方法相同。后续不同剂量的uc-msc细胞悬液制备步骤均与之相同，区别仅在于配置浓度不同，故后续不再陈述uc-msc细胞悬液制备步骤。
57.步骤三，正常细胞组和正常盐水组连续3周均进行注射，每周注射一次，共注射3次。
58.步骤四，第3次注射完成后一周，对正常细胞组和正常盐水组的仔鼠进行生物学检测，以正常盐水组为参考标准，分析细胞组中mrna的蛋白分子水平的变化，结果如图2和表1所示。需要说明书是，本发明进行生物学检测的方法为q-pcr法(下述实施例也是采用的该种生物学检测方法)。需要说明的是，mrna的相对含量可以通过本领域技术人员利用公知的方法来测定。例如，可以由细胞通过常规方法提取mrna并逆转录为cdna，后进行pcr扩增，最后使用比较ct方法计算pcr片段的相对量。由图2和表1可知，注射uc-msc细胞悬液后，仔鼠海马区的mrna发生明显变化。具体为：iba1明显升高，hgf、ng2、sox-2明显下降，β-ngf、cd133、gfap、nestin有下降趋势，syp有上升趋势。由此可知，脐带间充质干细胞对正常sd大鼠的海马区分子水平也能产生影响。注射uc-msc细胞悬液后，仔鼠额叶区的mrna也发生明显变化。具体为gfap明显升高，sox-2明显下降，iba1、nestin、syp有上升趋势，bdnf有下降趋势。由此可知，脐带间充质干细胞对正常sd大鼠的额叶区分子水平也能产生影响。综上，脐带间充质干细胞能够影响正常sd大鼠的海马区分子水平和额叶区分子水平。
59.表1正常细胞组仔鼠海马区和额叶区的mrna变化
[0060][0061]
实施例2.2本实施例探究不同浓度细胞量的间充质干细胞对正常sd大鼠的生物学效应。
[0062]
步骤一，正常sd大鼠受孕后笼观察其状态直至分娩，从仔鼠出生第28天开始，给予仔鼠尾静脉注射。根据仔鼠出生时间和数量，将正常sd大鼠的仔鼠随机分配为两组，一组为正常盐水组，一组为正常细胞组。两组仔鼠的数量一致，均为6只。正常盐水组给予仔鼠尾静脉注射生理盐水，正常细胞组给予仔鼠尾静脉注射uc-msc细胞悬液。
[0063]
步骤二，将正常细胞组平均分为两组，一组为低剂量正常细胞组，仔鼠所需细胞量为0.25*106/50g；一组为高剂量正常细胞组，仔鼠所需细胞量为2*106/50g。称取仔鼠重量，根据仔鼠重量制备低剂量uc-msc细胞悬液和高剂量uc-msc细胞悬液，同时留样做msc细胞流式检测。
[0064]
步骤三，高剂量正常细胞组和低剂量正常细胞组皆连续5周注射，每周注射一次，共注射5次。
[0065]
步骤四，第5次注射完成后一周，对高剂量正常细胞组和低剂量正常细胞组进行分子生物学检测和msc细胞流式检测，结果如图3、图4和表2所示。图3示出了高剂量正常细胞组和低剂量正常细胞组的msc细胞流式检测结果，cd90：99.98％，cd105：98.73％，cd73：99.87％，cd34/cd45/cd19/cd11b/hla-dr：0.69％。其结果符合msc检测标准，说明脐带间充质干细胞具有良好的多向分化能力和免疫调节能力。
[0066]
图4示出了高剂量正常细胞组仔鼠和低剂量正常细胞组仔鼠海马区和额叶区的mrna变化。在海马区，高剂量细胞量引起仔鼠mrna的明显变化(如图4所示)。bdnf、β-ngf、ng2明显上升，iba1、syp、β-ngf、cd133、gfap、hgf、nestin、ng2、sox-2也出现上升趋势。而低剂量细胞量中，β-ngf、cd133、gfap、hgf、nestin、ng2、sox-2也有上升趋势(如图7所示)，但上升程度低于高剂量正常细胞组。由此证明，在海马区中，脐带间充质干细胞能够影响正常细胞组大鼠的mrna相对含量，高剂量细胞量的作用比低剂量细胞量的作用更明显。
[0067]
在额叶区，高剂量细胞也在一定程度上引起mrna变化(如图4所示)。bdnf、β-ngf、gfap、hgf、ng2、sox-2、syp有上升趋势，cd133有下降趋势。低剂量细胞量中，bdnf、gfap、hgf、ng2、sox-2、syp、nestin有上升趋势，cd133、ng2有下降趋势。由此证明，在额叶区中，脐带间充质干细胞能够影响正常细胞组大鼠的mrna相对含量，但影响并不明显，无论是高剂
量细胞量还是低剂量细胞量，影响也不明显。
[0068]
表2高剂量正常细胞组仔鼠和低剂量正常细胞组仔鼠海马区和额叶区的mrna变化
[0069][0070][0071]
实施例3本实施例涉及脐带间充质干细胞应用于精神分裂症sd大鼠。
[0072]
实施例3.1动物模型的构建
[0073]
为了模拟精神分裂症患者认知功能障碍和情绪缺陷(即阴性症状)，本实施例使用了产前暴露于母体免疫激活的后代精神分裂症大鼠为动物模型。其模型是采用成功受孕的母鼠，在第九天尾静脉注射多聚胞苷酸(poly i:c)溶液，然后对母鼠炎症水平进行测定，确定是否造模成功。具体动物模型的构建方法(见图5)如下：
[0074]
步骤一，将大鼠置于实验室标准环境下进行饲养，温度控制在22
±
20℃，湿度控制在50
±
10％。大鼠在3个月大时进行交配育种，次日早晨检查阴道涂片，显微镜下观察到精子即为成功受孕，记录为孕0.5天(gd0.5)。
[0075]
步骤二，将成功受孕的母鼠分笼，随机分为数量相等的正常大鼠组和模型大鼠组(control group)。在孕九天，对模型大鼠组孕鼠进行尾静脉注射多聚胞苷酸(poly i:c)溶液(10mg/kg)；对正常大鼠组孕鼠尾静脉注射无菌生理盐水(0.9％)。注射三小时后均进行尾静脉采血，采血量为1ml/每只。采血后用双抗体夹心法进行il-6和tnf-α含量检测，检测结果如图6所示。图6示出了母鼠炎症因子水平，由图5可知，注射poly i:c病毒的孕鼠，三个小时后血清中的il-6和tnf-α的浓度均明显升高。说明注射poly i:c病毒已经对孕鼠免疫激活，使其产生炎症。需要说明的是：双抗体夹心法为本领域常规方法，此处不再赘述。
[0076]
步骤三，子代大鼠出生两个月后，分别对正常大鼠组的仔鼠和模型大鼠组的仔鼠进行惊跳反射弱刺激抑制(ppi)行为学检测，结果如图7所示。由图7可知，poly i:c病毒作用于孕鼠后，其仔鼠对ppi的抑制率降低，说明子代精神分裂症大鼠模型制备成功，该动物模型的构建方法可用与后续间充质干细胞对精神分裂症治疗效果的验证。
[0077]
实施例3.2探究间充质干细胞对精神分裂症sd子鼠的生物学效应和行为学效应。
[0078]
步骤一，将成功受孕的孕鼠分为两组。在孕九天时，分别进行尾静脉注射。对其中一组孕鼠进行尾静脉注射多聚胞苷酸(poly i:c)溶液，作为模型组sd大鼠；另外一组孕鼠尾静脉注射无菌生理盐水(0.9％)，作为正常组sd大鼠。注射三小时后均进行尾静脉采血。
[0079]
步骤二，待仔鼠出生后28天，正常组sd大鼠的仔鼠作为对照组，继续注射无菌生理盐水(0.9％)(control+saline，或c+s)，注射量为500μl，本组包括6只仔鼠。模型组sd大鼠的仔鼠随机分为两组，一组为治疗组，注射uc-msc细胞悬液(poly1：c+mscs，或p+m)，本组包括8只仔鼠，本组所需细胞数量具体为2*106/50g，uc-msc细胞悬液的注射剂量为500μl。另一组为疾病组，继续注射无菌生理盐水(0.9％)(poly1：c+saline，或p+s)，注射量为500μl，本组包括6只仔鼠。
[0080]
步骤三，对对照组、疾病组和治疗组三组仔鼠进行连续5周注射，每周注射一次，共注射5次。
[0081]
步骤四，最后一次注射完一周后，对对照组、疾病组和治疗组三组仔鼠进行分子生物学检测和行为学测定。本实施例的分子生物学检测之一是对仔鼠额叶区的β-ngf、d2、iba1的mrna相对含量进行检测，检测结果如图8和表3所示。根据图8和表3可以得出：对照组和治疗组基本相一致，疾病组β-ngf、iba1相对含量升高，d2相对含量有上升趋势。由此可知，在额叶区，精神分裂仔鼠由于脑细胞病变，会导致β-ngf、d2、iba1的mrna相对含量明显升高，而经过msc治疗后，其β-ngf、d2、iba1的mrna相对含量恢复正常，基本与对照组一致水平。由此证明，脐带间充质干细胞能明显调控精神分裂症子鼠中的β-ngf、d2、iba1三种mrna的相对含量。由此可知，本发明的脐带间充质干细胞能够用于制备治疗精神分裂症药品，亦能用于精神分裂症诊断、用于精神分裂症药物疗效评估。
[0082]
表3对照组、疾病组和治疗组仔鼠海马区和额叶区的mrna变化
[0083][0084]
本实施例的分子生物学检测之二是蛋白质免疫印迹分析，具体步骤为：蛋白质样品的制备与sds-page(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)分离。从脑组织细胞样本中制备靶点蛋白，后用免疫印迹方法来测蛋白含量(图9)。首先按
常规方法进行sds-page，将蛋白质从凝胶转移到nc膜上。然后进行免疫检测和靶蛋白(抗原)检测。具体为被转印到膜上的靶抗原与抗体(特异抗体)反应、与酶标第二抗体(抗抗体)反应，以及用酶相应的底物处理后进行靶蛋白(抗原)信号检测。
[0085]
检测结果如图9和图10所示。根据图9和图10可知，疾病组(p+s)仔鼠由于精神分裂导致脑细胞病变，从而导致突触素sy38下降，影响神经递质的传导。而治疗组(p+m)子鼠经过msc治疗后，其突触素sy38又恢复到对照组子鼠(c+s)相应水平。说明msc能治疗精神分裂导致的突触损伤，进而推知msc对精神分裂症子鼠有治疗作用。由此可知，进一步利于本发明的脐带间充质干细胞能够用于制备治疗精神分裂症药品。
[0086]
本实施例的分子生物学检测之三是神经元检测，具体步骤为：(1)分离脑组织。即解剖小鼠，剥离大脑皮层组织至hbss缓冲液(hank's balanced salt solution)中。(2)分离神经元。将分离出的大脑皮层组织用预冷的分离缓冲液冲洗两次，后放入5ml组织消化液，在37℃下消化18分钟；吸弃组织消化液，加入5-10ml neuron chow(含fbs)终止消化；用70μm细胞过滤网将细胞悬液过滤，取滤液，接种培养，每隔3天换一次液。(3)细胞转染。培养至14-16天后即进行细胞转染，div11转染egfp荧光质粒，div12用5mm-ma处理48h，可以帮助我们观察不同组别的海马神经元形态差异。(4)荧光素标记。选择转染效果比较好的细胞爬片，用巴氏管吸取干净培养液，pbs洗三遍，用4％多聚甲醛固定15min。pbs清洗3遍用，正常山羊血清室温封闭30min，用一抗(c1q，complement component 1)4℃孵育过夜。pbs清洗3遍，用相应二抗37℃孵育1h，洗片，滴加dapi(4',6-diamidino-2-phenylindole)避光孵育5min。pbs清洗4遍，用吸水纸吸干爬片上的液体，最后用含抗荧光淬灭剂的封片液封片。在荧光显微镜下观察标本的特异性荧光强度、采集图像。
[0087]
检测结果如图11和图12所示。根据图11可知，疾病组(p+s)仔鼠由于精神分裂症使得神经元受损，只检测到神经元形态，未观察到c1q信号。而治疗组(p+m)子鼠经过msc治疗后，神经信号恢复(如图12所示)。由此可知，进一步利于本发明的脐带间充质干细胞能够用于制备治疗精神分裂症药品。
[0088]
本实施例的行为学测定包括行为学-旷场检测和行为学-y-迷宫检测。行为学-旷场检测装置由旷场箱体、摄像系统和视频记录分析软件共同构成。实验时将动物放入旷场中的特定位置，用摄像系统来监测动物在旷场中的活动情况，通过分析软件来进行动物的轨迹追踪和数据采集分析。具体方法为：将仔鼠取出，放置到旷场的中央区域，实验者迅速离开，任其在实验箱自由活动。迅速开启软件的视频采集或摄像系统的视频录制，记录仔鼠在旷场中10min的活动情况，结果如图13所示。根据图13可知，疾病组仔鼠由于精神分裂导致脑细胞病变，仔鼠在旷场中活动到中心距离和总距离都最短；而治疗组仔鼠经过msc治疗后，其活动到中心距离、总距离都和对照组仔鼠活动距离相一致。这就说明经过msc治疗后，精神分裂症仔鼠恢复到正常活动能力。由此可知，本发明的脐带间充质干细胞能够用于制备治疗精神分裂症药品，尤其是改善认知功能障碍；同时亦能用于精神分裂症诊断、用于精神分裂症药物疗效评估。
[0089]
行为学-y-迷宫检测的y迷宫，由3等长臂组成(50cm
×
18cm
×
35cm)，每两个臂之间夹角为120度，在中央处各有一个可移动的隔板，迷宫内臂及底部均涂为黑色。将仔鼠放在y迷宫任意一臂末端，任其自由探索8min，摄像系统记录动物8min的行为变化，记录其进入新异臂的时间，结果如图14所示。根据图14可知，疾病组(p+s)子鼠由于精神分裂导致脑细胞
病变，子鼠在y-迷宫中进入新异臂的时间最短，而治疗组(p+m)子鼠经过msc治疗后，其进入新异臂的时间和对照组子鼠(c+s)相一致。这就说明经过msc治疗后，精神分裂症子鼠恢复到正常活动能力。由此可知，本发明的脐带间充质干细胞能够用于制备治疗精神分裂症药品，尤其是改善认知功能障碍；同时亦能用于精神分裂症诊断、用于精神分裂症药物疗效评估。
[0090]
结论：通过实施例3.2可以得出，精神分裂症子鼠经过脐带间充质干细胞治疗后，各项指标都恢复到和正常子鼠一致水平，也就说明采用本发明脐带间充质干细胞治疗精神分裂症子鼠的方法，对治疗患有精神分裂症的子鼠有明显的治疗改善作用。
[0091]
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。