一种魏氏梭菌抑制剂及其制备方法和应用与流程

1.本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种魏氏梭菌抑制剂及其制备方法和应用。


背景技术：

2.魏氏梭菌是产气荚膜梭菌的简称，是畜禽坏死性肠炎、红痢、胀气猝死等症状的主要致病菌。该菌广泛存在于动物肠道中，正常情况下数量较少，不会致病，但当某些诱发因素存在时，魏氏梭菌会快速增殖，并分泌毒素，导致肠道损伤、腹泻、死亡等问题。近年来，魏氏梭菌感染导致的疾病发生率增加较多，分析主要原因：一是饲料端禁抗，导致细菌性疾病的防控压力增加；二是由于原料价格高涨，饲料中非常规原料的广泛使用、霉菌毒素等给肠道健康带来威胁，增加了魏氏梭菌爆发的风险。因此，研究一种科学、成分天然、有效的魏氏梭菌抑制剂非常重要。


技术实现要素：

3.本发明提供了一种魏氏梭菌抑制剂及其制备方法和应用。所述魏氏梭菌抑制剂枯草芽孢杆菌s2及其代谢产物为主要成分，对魏氏梭菌具有显著的抑制效果，且在猪、蛋鸡和种鸭等不同养殖动物上均可预防与治疗魏氏梭菌的感染。
4.为实现上述发明目的，本发明通过下述技术方案予以实现：
5.本发明提供了一种魏氏梭菌抑制剂，其包括枯草芽孢杆菌活菌、枯草芽孢杆菌代谢产物和可溶性载体。
6.进一步的，所述魏氏梭菌抑制剂中，枯草芽孢杆菌活菌的质量比为8％-10％，枯草芽孢杆菌代谢产物的质量比为80％-90％，其余为可溶性载体。
7.进一步的，所述枯草芽孢杆菌活菌和枯草芽孢杆菌代谢产物均采用保藏编号为cgmcc no.19824的枯草芽孢杆菌s2制备获得的。
8.本发明还提供了所述的魏氏梭菌抑制剂的制备方法，包括以下步骤为：
9.(1)将活化的枯草芽孢杆菌接种到活菌发酵培养基中，于36℃～38℃发酵28h-32h，得到枯草芽孢杆菌活菌；
10.(2)将活化的枯草芽孢杆菌接种到装有代谢产物发酵培养基的种子罐中，于28℃～32℃，培养16h-20h，再以4-6％的接种量接种到装有代谢产物发酵培养基的发酵罐中，于28℃～32℃发酵20h-24h，产物喷雾干燥，得到枯草芽孢杆菌代谢产物；
11.(3)将枯草芽孢杆菌活菌、枯草芽孢杆菌代谢产物、可溶性载体混合均匀，得到魏氏梭菌抑制剂。
12.进一步的，所述活菌发酵培养基的配方为：豆饼粉30g/l-35g/l，酵母粉20g/l-25g/l，葡萄糖20g/l-25g/l，氯化钠1.5g/l-2g/l，消泡剂1g/l-2g/l，中性蛋白酶8g/l-10g/l，硫酸锰0.2g/l-0.3g/l。
13.进一步的，所述代谢产物发酵培养基的配方为：豆饼粉10g/l-15g/l，酵母粉20g/
l-25g/l，鱼粉25g/l-30g/l，葡萄糖15g/l-20g/l，氯化钠8g/l-12g/l，氯化钾1g/l-2g/l，消泡剂1g/l-2g/l，中性蛋白酶10g/l-15g/l。
14.本发明还提供了所述的魏氏梭菌抑制剂在制备动物病原菌抑菌剂中的应用。
15.进一步的，所述动物病原菌为大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和魏氏梭菌。
16.本发明还提供了所述的魏氏梭菌抑制剂在制备防治魏氏梭菌感染的禽畜动物饲料添加剂中的应用。
17.进一步的，所述魏氏梭菌抑制剂的添加量为250g/t～500g/t。
18.进一步的，所述禽畜动物为母猪、蛋鸡、种鸭。
19.进一步的，所述魏氏梭菌抑制剂用于养殖母猪时，添加量为500g/t饲料，饲喂时间为12d。
20.进一步的，所述魏氏梭菌抑制剂用于养殖蛋鸡时，添加量为500g/t饲料，饲喂时间为40d。
21.进一步的，所述魏氏梭菌抑制剂用于养殖种鸭时，添加量为250g/t水，饮用时间为12d。
22.与现有技术相比，本发明的优点和有益效果是：
23.本发明利用枯草芽孢杆菌s2及其发酵产物制备了一种能够显著抑制魏氏梭菌的抑制剂，枯草芽孢杆菌s2具有很好的絮凝能力和很好的产吲哚乙酸的能力，因此，抑制剂抑制魏氏梭菌的效果优于亚甲基水杨酸杆菌肽和恩拉霉素，并且在养殖动物—猪、蛋鸡和种鸭上均表现出立竿见影的效果，不仅能够防治动物体内的魏氏梭菌，还能够提高动物的产量、改善粪便形态，降低日死淘数，有利于动物的生长，减轻魏氏梭菌对畜禽动物的危害，避免为养殖户造成较大的经济损失，具有较高的推广和应用价值。
24.除此之外，本发明还提供了一种畜禽粪便魏氏梭菌快速检测方法，其简化了魏氏梭菌检测步骤，仅通过粪便采集器畜禽养殖现场取样稀释，生化反应管显色反应，对比标准显色卡，就能够轻松的检测畜禽的魏氏梭菌感染情况。
附图说明
25.图1为魏氏梭菌抑制剂和抗生素类产品对大肠杆菌的mic对比；
26.图2为魏氏梭菌抑制剂和抗生素类产品对金黄色葡萄球菌的mic对比；
27.图3为魏氏梭菌抑制剂和抗生素类产品对沙门氏菌的mic对比；
28.图4为魏氏梭菌抑制剂和抗生素类产品对魏氏梭菌的96孔板对比，其中ab列为亚甲基水杨酸杆菌肽，cd列为恩拉霉素，ef列为魏氏梭菌抑制剂，gh为对照组；
29.图5为魏氏梭菌抑制剂和抗生素类产品对魏氏梭菌的mic对比；
30.图6为试验前(a)后(b)妊娠母猪的魏氏梭菌感染检测；
31.图7为不同阶段检测鸡舍中魏氏梭菌感染情况，其中a为第一次检测，b为第二次检测，c为第三次检测；
32.图8为在种鸭上使用魏氏梭菌抑制剂前后魏氏梭菌检测情况，其中前后检测为相同反应时间的对比结果；
33.图9为在种鸭上使用魏氏梭菌抑制剂前后产蛋率的变化(箭头处为抑制剂添加时间)；
34.图10为在种鸭上使用魏氏梭菌抑制剂前后日死淘数的变化(箭头处为抑制剂添加时间)；
35.图11为在种鸭上使用魏氏梭菌抑制剂前后粪便的变化。
具体实施方式
36.结合以下具体实例对本发明的技术方案作进一步详细的说明。
37.下述实施例中，如无特殊说明，所使用的试验方法均为常规方法，所用材料、试剂等均可从生物或化学试剂公司购买。
38.下述实施例中所需培养基的配方如下：
39.1、lb液体培养基：蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，蒸馏水1l。
40.2、lb固体培养基：蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，琼脂粉15-18g，蒸馏水1l。
41.3、rcm液体培养基：蛋白胨10g，牛肉膏/粉1％，酵母粉5g，葡萄糖10g、可溶性淀粉1g，氯化钠5g，醋酸钠3g，l-半胱氨酸盐酸盐0.5g，蒸馏水1l，ph6.8
±
0.1。
42.4、rcm固体培养基：蛋白胨10g，牛肉粉10g，酵母粉5g，葡萄糖10g，可溶性淀粉1g，氯化钠5g，醋酸钠3g，l-半胱氨酸盐酸盐0.5g，琼脂15-18g，蒸馏水加至1000ml，调ph值为6.8
±
0.1。
43.上述培养基在使用前，需在116℃下灭菌30min，然后室温保存备用。
44.实施例1
45.一种畜禽粪便中魏氏梭菌的快速检测方法，包括以下步骤：
46.(1)通过粪便采样器采集约1g畜禽养殖场各个采样点粪便；
47.(2)将粪便采样器中的粪便混匀稀释；
48.(3)用无菌棉签充分蘸取粪便稀释液；
49.(4)配置魏氏梭菌生化反应培养基(配方为胰蛋白胨15g，蛋白胨5g，柠檬酸铁铵1.5g，酵母粉5.0g，偏重亚硫酸钠1.5g，半胱氨酸盐酸盐1g，琼脂粉20g，蒸馏水1l)；
50.(5)取生化反应管，然后在生化反应管中加入10ml生化反应培养基，并将其置于生化反应器中，100℃加热1h，冷却到42℃备用；
51.(6)把蘸取粪便稀释液的棉签插入步骤(5)的生化反应管中，42℃培养，然后每隔1h观察生化反应管中棉签有无黑色沉淀，并记录黑色沉淀生成变化，记录1-5h；
52.(7)对比魏氏梭菌标准卡(表1)，确认粪样中魏氏梭菌的数量。
53.表1：魏氏梭菌标准卡
54.显色时间(h)魏氏梭菌数量(cfu/g)11
×
10821
×
10731
×
10641
×
10551
×
10455.实施例2：魏氏梭菌抑制剂的制备
56.魏氏梭菌抑制剂中是由枯草芽孢杆菌s2及其代谢产物、可溶性载体组成的。
57.枯草芽孢杆菌s2的保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
(cgmcc)；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏日期：2020年05月15日；枯草芽孢杆菌bacillus subtilis的保藏编号为：cgmcc no.19824。
58.魏氏梭菌抑制剂的制备步骤为：
59.1、配置培养基：
60.(1)活菌发酵培养基配方为：豆饼粉30g-35g，酵母粉20g-25g，葡萄糖20g-25g，氯化钠1.5g-2g，消泡剂1g-2g，中性蛋白酶8g-10g，硫酸锰0.2g-0.3g，蒸馏水1l。
61.(2)代谢产物发酵培养基配方为：豆饼粉10g-15g，酵母粉20g-25g，鱼粉25g-30g，葡萄糖15g-20g，氯化钠8g-12g，氯化钾1g-2g，消泡剂1g-2g，中性蛋白酶10g-15g，蒸馏水1l。
62.以上培养基经121℃高温灭菌15-20min，然后室温保存备用。
63.2、将活化的枯草芽孢杆菌s2以4-6％的接种量接种到活菌发酵培养基中，于37℃
±
0.5℃，发酵28h-32h，得到枯草芽孢杆菌活菌。
64.3、将活化的枯草芽孢杆菌s2以4-6％的接种量接种到种子罐中，种子罐中添加有代谢产物发酵培养基，于30℃
±
0.5℃、罐压0.05mpa、自然ph下培养16h-20h，然后再以4-6％的接种量接种到装有代谢产物发酵培养基的发酵罐中，于30℃
±
0.5℃、罐压0.05mpa、自然ph下培养20h-24h；停罐后正常喷雾干燥即可，控制喷雾进口温度不高于180℃，出口不高于72℃，得到枯草芽孢杆菌代谢产物。
65.4、将枯草芽孢杆菌活菌、枯草芽孢杆菌代谢产物、可溶性载体混合均匀，得到魏氏梭菌抑制剂。其中，在魏氏梭菌抑制剂中，枯草芽孢杆菌活菌的质量比为8％-10％，发酵液中活菌数量不少于100亿；枯草芽孢杆菌代谢产物的质量比为80％-90％，余量均为可溶性载体。
66.实施例3：魏氏梭菌抑制剂和市场同类抗生素的体外mic试验评估
67.1、试验步骤：
68.(1)样品液制备：亚甲基水杨酸杆菌肽、恩拉霉素和魏氏梭菌抑制剂分别10倍稀释后，10000rpm，离心5min，取上清液，用0.22μm滤膜过滤后备用。
69.(2)病原菌悬液制备：大肠杆菌atcc25922、金黄葡萄球菌atcc25923和沙门氏菌atcc14028经lb平板划线活化，挑菌至lb液体试管37℃摇床200rpm培养24h，稀释至1
×
106cfu/ml备用。魏氏梭菌atcc13124用rcm平板活化，rcm液体培养基静置厌氧培养，37℃培养16h后稀释至1
×
106cfu/ml备用。
70.(3)96孔板法测定mic(以魏氏梭菌为例)：在96孔无菌平板中，采用2倍稀释法稀释样品。从a1-a12孔中分别加入100μl无菌rcm液体培养基，将100μl稀释的样品液加入a1孔中，移液器吸打混匀后，吸取100μl加入a2孔中，吸打混匀后再吸取100μl加入同排a3孔中，以此类推，直至第12孔，混匀后吸弃100μl，再a1-a12孔中加入100μl魏氏梭菌稀释液，b-f行同a行。g-h行孔中加入100μl魏氏梭菌液作为对照组。
71.2、试验结果：如图1-图5和表2所示，其中表2中的数据为了和图1-图5中相对应，以96孔平板中的稀释倍数统计。魏氏梭菌抑制剂对四种病原菌均有不同程度的抑制作用，而市场抗生素类产品—亚甲基水杨酸杆菌肽和恩拉霉素对大肠杆菌、沙门氏菌无任何抑菌效果，亚甲基水杨酸杆菌肽对金黄色葡萄球菌也无抑菌效果；恩拉霉素对金黄色葡萄球菌的抑菌效果比魏氏梭菌抑制剂差。对魏氏梭菌的抑制效果，亚甲基水杨酸杆菌肽为781ppm(对
应稀释倍数为1280倍)，恩拉霉素为390ppm(对应稀释倍数为2560倍)，而魏氏梭菌抑制剂仅为6ppm(对应稀释倍数为163840倍)，说明魏氏梭菌抑制剂对魏氏梭菌具有很好的抑制效果。
72.表2：魏氏梭菌抑制剂和抗生素类产品对比数据
[0073][0074]
实施例4：魏氏梭菌抑制剂在畜禽养殖现场的应用
[0075]
案例一、对妊娠母猪魏氏梭菌感染的治疗效果评价
[0076][0077][0078]
在试验前以及饲喂魏氏梭菌抑制剂12d后，检测母猪粪便中的魏氏梭菌含量，并对比。结果如图6和表3所示，试验组对治疗中重度魏氏梭菌感染有较好的效果，且和对照组相比，感染有60％的改善率。
[0079]
表3：魏氏梭菌抑制剂在妊娠母猪魏氏梭菌治疗前后的统计数据
[0080][0081]
备注：试验前后的检测为相同反应时间的对比结果。
[0082]
案例二、对蛋鸡魏氏梭菌感染的应用效果评价
[0083][0084]
在试验前、第一阶段结束后、第二阶段结束后分别检测鸡舍粪便中的魏氏梭菌数量。结果图7和表4所示，试验前(第一次检测)，鸡舍的魏氏梭菌感染比较严重，属于中重度感染，60％-80％的鸡舍粪便中的魏氏梭菌数量≥1
×
108cfu/g。第一阶段结束后(第二次检测)检测显示，4栋中有3栋鸡舍中的魏氏梭菌感染已明显降低，只有20％的鸡舍粪便的魏氏梭菌数量≥1
×
108cfu/g。第二阶段结束后(第三次检测)检测显示，有3栋鸡舍中粪便的魏氏梭菌已经降到1
×
108cfu/g以下，第一栋已经100％降到1
×
107cfu/g以下。
[0085]
表4：魏氏梭菌抑制剂在蛋鸡上的效果
[0086][0087]
备注：三次检测为相同反应时间的对比结果。
[0088]
案例三、对种鸭魏氏梭菌感染的治疗效果评价
[0089][0090]
在试验前后检测种鸭粪便中的魏氏梭菌数量以及产蛋率、日死淘数、粪便形态等。结果如图8-图11所示，在试验前，种鸭粪便中梭菌数量均为10
7-108cfu/g，属于重度感染情况。试验后种鸭粪便中魏氏梭菌的数量大幅度降低，由1
×
108cfu/g降至1
×
104cfu/g(图8)，说明防控魏氏梭菌感染的效果非常显著；且在产蛋率、日死淘数、粪便形态以及种蛋合格
率、受精率上均有明显改善，其中产蛋率从24％提高至37％(图9)，日死淘数由4只以上降低值4只以下(图10)，粪便形态上：料便、水便均得到改善，粪便成型度明显提高(图11)。
[0091]
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。