一种编码两种杀虫蛋白的智能设计基因BTbv及其应用

一种编码两种杀虫蛋白的智能设计基因btbv及其应用
技术领域
1.本发明属于基因工程、合成生物学及生物智能技术领域，尤其涉及一种编码两种杀虫蛋白的智能设计基因btbv及其应用。


背景技术：

2.苏云金芽胞杆菌来源的各种杀虫蛋白及其人工改造的衍生蛋白是目前杀虫转基因农作物主要的杀虫功能性基因的主要来源。这些杀虫蛋白主要包含编码杀虫晶体蛋白(icps)的cry类和cyt类基因，以及编码营养期杀虫蛋白(vip)的vip类基因。三类基因表达蛋白、杀虫机制及杀虫性不尽相同。通常认为cry蛋白作用机制包括溶解、酶解活化、与受体结合、插入和形成孔道和离子通道等过程。在过去的几十年里，已确定数十种苏云金芽孢杆菌菌系及130多种编码的杀虫晶体蛋白。
3.上述杀虫基因在玉米、水稻、棉花等转基因杀虫种质的开发与利用中取得了显著成绩。然而，伴随着转基因作物的开发，田间害虫对不同类型的bt蛋白抗性也在不断进化。为防止转基因作物中杀虫基因在短时间内因害虫抗性进化而失效，通常选择将多个杀虫蛋白在同一个转基因植株中同时表达的方式来解决这一突出问题。采用的策略多是将不同杀虫转基因植株进行杂交和回交转育，或者构建多价杀虫基因的植物表达载体进行遗传转化。前者将花费大量的时间和人力资源，不利于快速开展转基因育种工作。尽管后者一定程度上解决了上述问题，但由于载体构建过程中每个基因的增加都需要引入独立的启动子和终止子等转录调控元件，存在着转基因安全隐患的增加而需要进行更多的安全性评估。


技术实现要素：

4.有鉴于此，本发明的目的在于提供一种编码两种杀虫蛋白的智能设计基因btbv及其应用，本发明不同以往编码单个杀虫蛋白的天然或人工改造基因，能够同时编码两种独立的杀虫蛋白cry1ab-like和vip3aa-like蛋白，有效提高杀虫活性和杀虫谱。
5.为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
6.本发明提供了一种编码两种杀虫蛋白的智能设计基因btbv，所述基因btbv的核苷酸序列如seq id no.1所示。
7.优选的，所述基因btbv是由lp4/2a自剪切肽介导的cry1ab-like和vip3aa-like两个杀虫蛋白共表达而成。
8.优选的，所述的lp4/2a自剪切肽的氨基酸序列如seq id no.2所示；所述cry1ab-like的氨基氨酸序列如seq id no.3所示；所述vip3aa-like的氨基氨酸序列如seq id no.4所示。
9.本发明还提供了一种含有上述基因btbv的表达载体。
10.本发明还提供了一种上述基因btbv或表达载体在培育杀虫转基因植株中的应用。
11.优选的，所述植株包括玉米。
12.优选的，所述虫包括鳞翅目害虫。
13.进一步优选的，所述鳞翅目害虫包括玉米螟、玉米粘虫、草地贪夜蛾和棉铃虫中的一种或多种。
14.相对于现有技术，本发明具有如下有益效果：
15.本发明提供了一种编码两种杀虫蛋白的智能设计基因btbv及其应用，本发明中通过对智能设计的基因文库筛选获得杀虫基因btbv，其能够实现在玉米细胞中较高水平表达两种杀虫蛋白即cry1ab-like和vip3aa-like蛋白，该基因btbv不仅避免靶标害虫对其杀虫蛋白耐受性进化的风险，还能够有效提高杀虫活性和杀虫谱。此外，本发明的基因btbv在转基因材料中的表达量高，因此能够更容易获得杀虫效果。
附图说明
16.图1为基于lp4/2a自剪切肽共表达多杀虫蛋白基因文库的建立示意图；
17.图2为外源蛋白在转基因玉米与玉米胚芽鞘无细胞表达系统中表达量比较的柱状与折线组合图；
18.图3为外源蛋白在转基因玉米与玉米胚芽鞘无细胞表达系统中表达量比较的箱型图；
19.图4为17种稀释后单克隆抗体对携带相应蛋白标签的杀虫蛋白的elisa标准曲线图；
20.图5为文库中的杀虫蛋白高表达基因克隆的获得与btbv基因优化及衍生图；
21.图6为智能设计基因btbv基因及其衍生基因的植物表达载体结构图；
22.图7为智能设计基因btbv基因及其衍生基因的瞬时转化表达量堆积图。
具体实施方式
23.本发明提供了一种编码两种杀虫蛋白的智能设计基因btbv，所述基因btbv的核苷酸序列如seq id no.1所示。
24.在本发明中，所述基因btbv优选的是由lp4/2a自剪切肽介导的cry1ab-like和vip3aa-like两个杀虫蛋白共表达而成。进一步优选的，所述基因btbv的核苷酸序列的第4～2496位为cry1ab-like，第2497～2580位为lp4/2a自剪切肽，第2581～4479位为vip3aa-like。本发明的基因btbv提高了所表达的杀虫蛋白表达量。
25.本发明利用自剪切肽连接两个杀虫蛋白的氨基酸编码序列的智能设计策略，自剪切肽其序列在翻译过程中形成的高级结构对核糖体肽基转移酶中心造成空间位阻，导致无法形成正常的肽链连接，而使得核糖体能继续翻译下游蛋白，从而形成一种类似蛋白水解酶的作用将前后两个蛋白顺式“切开”的原理，实现在玉米细胞中，仅使用一个共同的启动子和终止子构建的单价基因表达框内实现两个杀虫蛋白的共表达。同时，由于将不同种类的杀虫蛋白进行组合、排列，可能这种智能设计基因在宿主细胞中的表达水平受到转录水平及转录后水平的基因表达调控影响。本发明结合不同杀虫蛋白编码基因随机重组文库的构建与无细胞模拟植物细胞表达水平及杀虫活性的分子实验高通量筛选，鉴定出具有高抗玉米螟、草地贪夜蛾、玉米粘虫、棉铃虫等主要害虫的候选基因，进一步优化并比较其与衍生基因在玉米瞬时转化获得的杀虫蛋白产物进行不同害虫的杀虫效果比较，从而获得较其杀虫候选基因显著具有高表达及高杀虫性的新型智能设计基因，即btbv。
26.在本发明中，所述基因btbv的制备方法包括以下步骤：
27.1)首先利用限制性内切酶介导的17种鳞翅目杀虫蛋白编码基因随机排列方式，实现智能设计的多蛋白共表达重组基因文库的构建；
28.2)通过玉米胚芽鞘无细胞表达系统实现对上述重组蛋白的无细胞表达，模拟上述基因在玉米细胞中的表达情况；
29.3)通过对上述的重组蛋白的定量和杀虫效果分析，选择最佳的候选基因，并进一步改造，去掉研发过程中的蛋白标签；
30.4)最终通过化学合成法对上述优化后的基因序列进行全基因合成，并插入到克隆载体中，进行保存。
31.本发明的基因btbv遴选自编码抗鳞翅目害虫蛋白的融合基因文库的8000个克隆中，其中17个已知优异抗鳞翅目杀虫蛋白彼此间以lp4/2a自剪切肽连接，从而候选基因转录的mrna在核糖体中通过断裂跳跃方式翻译成两个独立的杀虫蛋白，且其在相同启动子驱动下可在玉米细胞中表达总杀虫蛋白含量较分别单独表达两种杀虫蛋白都高。本发明中的btbv基因较传统杀虫蛋白基因，可以同时表达两种杀虫蛋白，且提高了细胞中杀虫蛋白的表达量，显著提高转基因玉米的杀虫性。杀虫实验鉴定表明，转btbv基因的玉米植株对多种鳞翅目害虫具有较已有杀虫基因更好的杀虫性。
32.在本发明中，所述的lp4/2a自剪切肽的氨基酸序列如seq id no.2所示；所述cry1ab-like的氨基氨酸序列如seq id no.3所示；所述vip3aa-like的氨基氨酸序列如seq id no.4所示。
33.本发明还提供了一种含有上述基因btbv的表达载体。
34.本发明通过通过对杀虫蛋白的人工改造及其植物表达载体的优化增加了基因btbv在转基因材料中的表达量且不影响其原本杀虫功能。所述表达载体的骨架优选的包括peazy-bs或pcambia3301。
35.本发明还提供了一种上述基因btbv或表达载体在培育杀虫转基因植株中的应用。
36.在本发明中，所述植株优选的包括玉米。所述虫优选的包括鳞翅目害虫。进一步优选的，所述鳞翅目害虫包括玉米螟、玉米粘虫、草地贪夜蛾和棉铃虫中的一种或多种，所述的玉米螟优选为亚洲玉米螟。
37.下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
38.实施例1
39.1.1抗鳞翅目融合基因文库的建立：
40.1)根据文献报道和杀虫蛋白的室内毒性鉴定实验，选择了17个对鳞翅目害虫具有明显抗性作用的杀虫蛋白。为了在玉米无细胞表达系统中进行模拟表达和进行农杆菌介导的玉米瞬时转化以及稳定转化后获得的玉米转基因植株中对候选智能设计基因中编码的多个不同杀虫蛋白进行精确定量，在每个蛋白的n端，添加不同的蛋白标签，并利用与之对应的小鼠单克隆抗体对其进行定性及定量检测。而为了实现多个杀虫蛋白在同一个候选基因中翻译成彼此独立且不影响其空间结构的完整蛋白，将可利用mrna在核糖体中断裂跳跃方式实现多个蛋白在真核生物细胞中共表达的自剪切肽lp4/2a引入每个杀虫蛋白的c端。
41.2)完成上述重组蛋白的合理性设计后，利用gene designer 2.0软件对上述已经
添加了供定量检测的蛋白标签及具备自剪切功能多肽序列的17个杀虫蛋白进行反向编译，依据玉米密码子偏好性设计其编码基因，并在编码氨基酸序列的上下游引入lgui酶切位点，利用化学法合成这17个人工设计基因，结构见图1所示。
42.3)将含有lgui酶切位点的17个编码杀虫蛋白的人工设计基因进行消化处理，按照表1所述组分在37℃水浴中进行限制性酶切反应1hr，如图1所示释放出上游atg(本发明中除特殊说明序列书写方向均为5
’→3’
)，下游cat的粘性末端17个不同片段。反应结束后加热整个反应体系到80℃，并持续15min完全灭除限制性内切酶活性。再将该酶切反应产物用用5倍体积的氯仿进行抽提，抽提后的反应液用等体积的无水乙醇沉淀，再用无菌水重新溶解。
43.表1酶切反应体系
[0044][0045]
4)化学合成核酸短片段t7启动子，t7终止子，正反两条序列。用1
×
te缓冲液稀释片段浓度到10nmol/l，并按照表2和表3所述方式进行混合，将其置于离心管中密闭。在100ml沸水中，放置上述离心管，室温缓慢降温(0.5～1℃/min)。如图1所示，分别在其t7启动子下游形成atg的粘性末端，t7终止子上游形成cat的粘性末端。
[0046]
表2t7启动子退火反应体系
[0047][0048][0049]
表3t7终止子退火反应体系
[0050]
[0051]
5)再将上述具有atg/cat酶切黏性尾端的t7启动子，t7终止子以及17个编码杀虫蛋白的人工设计基因按照质量比1:1:20000(摩尔浓度比约为1:1:10)进行混合，并按照表4所述方式添加t4连接酶及其缓冲液等，并充分混匀。16℃反应20hr后，取上述反应液5μl作为模板，添加在表5所示反应体系中，进行pcr反应，反应条件：95℃预变性5min；95℃变性30sec，56℃退火30sec，72℃延伸5min，10个循环；72℃后延伸15min；16℃保存。
[0052]
表4片段连接反应体系
[0053][0054]
表5pcr反应体系
[0055][0056]
6)pcr反应产物，通过0.8％琼脂糖凝胶电泳检测并进行回收片段长度＞2.5kb的片段，从而淘汰图1所示的t7启动子和t7终止子之间无杀虫基因或仅有一个杀虫基因的重组片段。
[0057]
7)回收后的长度＞2.5kb的重组片段连入peazy-bs载体中，并转化大肠杆菌感受态细胞中，在抗生素(35mg/l卡那霉素与60mg/l氨苄青霉素混合而成)的培养基平皿中筛选。共计挑取单菌落约8000个，确保所有可能的2价杀虫蛋白和3价杀虫蛋白组合的编码基因单克隆达到2倍以上饱和覆盖，从而获得全部可能的融合候选基因，至此抗鳞翅目融合基因文库成功构建完成(见图1)。
[0058]
1.2玉米胚芽鞘无细胞表达系统的建立：
[0059]
1)建立玉米胚芽鞘无细胞表达系统，具体方式如下：郑58玉米种子在充分吸收水分后，至于28℃暗光条件下培养至玉米胚芽鞘长度为5～8cm时，用手术刀小心切割下来，加入等体积的19.5％的蔗糖溶液，利用研钵在碎冰上缓慢研磨至匀浆。并通过4层纱布进行初步过滤，以及800目细胞筛二次过滤，最后再通过12000g离心5min完全去除细胞及细胞碎片。为利用该无细胞表达系统能够尽可能还原外源基因转录后的mrna在玉米细胞中的转录
后水平调控与翻译水平调控对外源基因在玉米细胞中最终表达量的影响，因此并不对该系统组成成分进行过多的优化，玉米叶鞘提取液直接进行无细胞表达或置于4℃冰箱内保存不超过48hr。
[0060]
2)利用与上述1.1部分类似的方式，构建由t7启动子驱动的ppt基因、epsps基因、gfp基因、gus基因相同的无细胞表达载体，并按照表6所示，进行mrna的转录，37℃孵育3h，反应结束后75℃加热10min，成功获得待测试基因的mrna，稀释到100ng/μl，存储于-20℃冰箱备用。
[0061]
表6体外转录反应体系
[0062][0063]
3)取上述体外转录获得的待测试基因mrna，按照1:50比例，加入到0.2ml的新鲜制备的玉米胚芽鞘无细胞表达系统反应液中，为方便后继统计进行约30次技术重复，在25℃条件下反应6h，随即在沸水浴中处理5min终止反应。
[0064]
4)分别用商业化的ppt基因和epsps基因单克隆抗体进行elisa检测，为统计玉米叶鞘无细胞表达获得的目的蛋白与转基因植株中目的蛋白的表达量之间的关系，同时提取上述基因各自30个不同转化事件的转基因玉米胚芽鞘总蛋白，进行elisa检测。对不同表达体系获得的外源蛋白表达量进行成簇柱状图(转基因植株)和折线图(无细胞表达系统)分析，见图2。
[0065]
结果如图2所示，对于不同基因在转基因植株和无细胞系统中表达的趋势相对一致，其中epsps基因的表达量最低，然后是ppt基因和gfp基因的表达量，而gus基因的表达量最高。
[0066]
对上述数据进行箱型图分析，结果如图3所示：4种基因在无细胞表达系统中表达量的30次技术重复分布范围和30个生物学重复的玉米转基因植株胚芽鞘中外源蛋白的表达量相较，无细胞表达系统中外源蛋白编码基因(ppt、epsps、gfp、gus)表达量分布范围更为集中。统计相同基因转基因植株胚芽鞘与无细胞表达系统中外源蛋白表达量的平均值，无细胞表达系统中外源蛋白表达量约为转基因植株的4.1～6.45倍。因此，可以利用该系统模拟外源蛋白在玉米中的表达，并推断出基于转录后水平调控的外源蛋白在玉米细胞的高通量测试。
[0067]
1.3基于无细胞表达系统筛选高表达多蛋白
[0068]
1)利用大肠杆菌表达系统对上述17种n端携带不同多肽标签的杀虫蛋白进行原核表达，经纯化定量后作为标准品，对与之对应的单克隆抗体进行稀释度的确定，并确认其浓度比例，最终确定17种单克隆抗体浓度依次为1:5000，1:4535，1:8430，1:11505，1:3400，1:1575，1:3210，1:10230，1:2825，1:5700，1:3750，1:5065，1:3705，1:2145，1:5450，1:5430，
1:3895。
[0069]
如图4所示，经过上述稀释后，进行elisa检测目的蛋白浓度与od吸收值的曲线几乎处于完全重合，即完成了17个检测抗体浓度与目标蛋白质量浓度的均一化处理，而等比例混合上述稀释后的抗体就可以无视杀虫蛋白种类对混合蛋白的总质量进行定量。
[0070]
2)提取1.1部分中所获的8000个克隆中的质粒，并用t7 rna聚合酶进行体外转录获得其对应的mrna。利用新鲜制备的玉米胚芽鞘无细胞表达系统反应液进行转基因植株中外源蛋白的模拟表达。反应结束后，用均一化后的17种混合单克隆抗体为一抗，商业化的辣根过氧化酶标记的兔抗鼠为二抗，进行elisa鉴定。选择每个96孔板中表达量最高的克隆，并将这些克隆再次进行玉米胚芽鞘无细胞表达和elisa鉴定，为确保实验结果至少进行三次技术重复，并依据检测结果选择表达量最高的文库克隆。
[0071]
3)利用添加在基因上下游的t7启动子和t7终止子对其进行测序，结果如图5所示，该文库克隆为编码cry1ab和vip3aa两个蛋白的重组基因。将这两个位于蛋白n端进行文库筛选的蛋白标签替换成质体定位信号肽，并重新合成由lp4/2a自剪切肽介导的cry1ab-like和vip3aa-like两个杀虫蛋白共表达的智能设计基因btbv，所述基因btbv的核苷酸序列如seq id no.1所示。lp4/2a自剪切肽氨基酸序列、cry1ab-like和vip3aa-like两个杀虫蛋白的氨基酸序列分别见seq id no.2、seq id no.3，seq id no.4。
[0072]
其中，所述基因btbv的核苷酸序列如下：
[0073]
atggccccgaccgtgatggcgtcctccgcgaccgccgtcgccccgttccaggggcttaagtccaccgccaccctgccggttgctaggcgctctaccacctcccttgcgaaggtgtccaacggcggcaggatcaggtgcaacaacaccaagctgagcacccgcgccctgccgagcttcatcgactacttcaacggcatctacggcttcgccaccggcatcaaggacatcatgaacatgatcttcaagaccgacacgggtggcgacctcaccctcgacgagatcctgaagaaccaacagctccttaacgacattagcggcaagctggacggtgtgaacggcagcctgaacgacctgatcgcccagggcaacctgaacaccgagctgagcaaggagatccttaagatcgccaacgagcagaaccaggtgctgaacgacgtgaacaacaagctggacgccatcaacaccatgctgcgcgtgtacctgccgaagatcacctctatgctgagcgacgtgattaagcagaactacgccctgagcctccagatcgagtacctgagcaagcagctccaggagatcagcgacaagctggacatcatcaacgtgaacgtcctgattaacagcaccctgaccgagatcaccccggcctaccagcgcatcaagtacgtgaacgagaagttcgaagaactgaccttcgctactgaaaccagcagcaaggtgaagaaggacggcagcccggctgacattctggacgagctgactgagttgaccgagctggcgaaaagcgtgaccaagaacgacgtggacggcttcgagttctacctcaacacgttccacgacgttatggtgggcaataacctgttcggtcgctccgcccttaagaccgccagcgagcttatcacgaaggagaacgtcaagaccagcggcagcgaggtgggcaacgtgtacaacttcctgatcgtgctgaccgcgctccaggcccaggcgttcctgaccctgaccacctgtcgcaagctgctgggcctggccgacatcgactacaccagcatcatgaacgagcacttgaacaaggagaaggaggagttccgcgtgaacatcctgccgaccctgagcaacactttctctaacccgaactacgctaaggtgaagggcagcgacgaggacgccaagatgatcgtggaggctaagccgggccacgcgctgatcggcttcgagatcagcaacgacagcatcaccgtgctgaaggtgtacgaggccaagctgaagcaaaactaccaagtggacaaggacagcttgagcgaggtgatctacggcgacatggacaagctgctgtgtccagaccagagcgagcaaatctactacaccaacaacatcgtgttcccgaacgagtacgtcatcaccaagatcgacttcaccaagaagatgaagaccctgcgctacgaggtgacggccaacttctacgacagcagcaccggcgagatcgacctgaacaagaagaaggtggagagcagcgaggccgaataccgcaccctgagcgcgaacgacgacggcgtttacatgccactgggcgtgatcagcgaaaccttcctgaccccgatcaacggctttggcctccaggcggacgagaacagccgcctgattaccctgacctgtaagagctacctgcg
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[0074]
所述lp4/2a自剪切肽氨基酸序列如下：
[0075]
snaadevatllnfdllklagdvesnpgp(seq id no.2)。
[0076]
所述cry1ab-like的氨基酸序列如下：
[0077]
aptvmassatavapfqglkstatlpvarrsttslakvsnggrircnntklstralpsfidyfngiygfatgikdimnmifktdtggdltldeilknqqllndisgkldgvngslndliaqgnlntelskeilkianeqnqvlndvnnkldaintmlrvylpkitsmlsdvikqnyalslqieylskqlqeisdkldiinvnvlinstlteitpayqrikyvnekfeeltfatetsskvkkdgspadildelteltelaksvtkndvdgfefylntfhdvmvgnnlfgrsalktaselitkenvktsgsevgnvynflivltalqaqafltlttcrkllgladidytsimnehlnkekeefrvnilptlsntfsnpnyakvkgsdedakmiveakpghaligfeisndsitvlkvyeaklkqnyqvdkdslseviygdmdkllcpdqseqiyytnnivfpneyvitkidftkkmktlryevtanfydsstgeidlnkkkvesseaeyrtlsanddgvymplgvisetfltpingfglqadensrlitltcksylrelllatdlsnketklivppsgfisnivengsieednlepwkannknayvdhtggvngtkalyvhkdggisqfigdklkpkteyviqytvkgkpsihlkdentgyihyedtnnnledyqtinkrfttgtdlkgvylilksqngdeawgdnfiileispsekllspelintnnwtstgstnisgntltlyqggrgilkqnlqldsfstyrvyfsvsgdanvrirnsrevlfekrymsgakdvsemfttkfekdnfyielsqgnnlyggpivhfydvsik(seq id no.3)。
[0078]
所述vip3aa-like的氨基酸序列如下：
[0079]
rclvvllavfalsqgdnnpninecipynclsnpevevlggerietgytpidislsltqfllsefvpgagfvlglvdiiwgifgpsqwdaflvqieqlinqrieefarnqaisrleglsnlyqiyaesfreweadptnpalreemriqfndmnsalttaiplfavqnyqvpllsvyvqaanlhlsvlrdvsvfgqrwgfdaatinsryndltrlignytdhavrwyntglervwgpdsrdwirynqfrreltltvldivslfpnydsrtypirtvsqltreiytnpvlenfdgsfrgsaqgiegsirsphlmdilnsitiytdahrgeyywsghqimaspvgfsgpeftfplygtmgnaapqqrivaqlgqgvyrtlsstlyrrpfniginnqqlsvldgtefaygtssnlpsavyrksgtvdsldeippqnnnvpprqgfshrlshvsmfrsgfsnssvsiirapmfswihrsaefnniipssqitqipltkstnlgsgtsvvkgpgftggdilrrtspgqistlrvnitaplsqryrvriryasttnlqfhtsidgrpinqgnfsatmssgsnlqsgsfrtvgfttpfnfsngssvftlsahvfnsgnevyidriefvpaevtfeaeykdel(seq id no.4)。
[0080]
实施例2
[0081]
实施例1得到的智能设计btbv基因及其衍生基因的瞬时表达分析
[0082]
1)为探究lp4/2a自剪切肽连接的两个蛋白表达量与其先后位置关系的影响，利用基因工程相关技术分别节选其中单独两个蛋白编码核酸序列，以及颠倒两个蛋白前后顺序，三种衍生基因。利用商业化载体pcambia3301分别构建由35s启动子驱动的cry1ab-like蛋白编码基因cry1abm，vip3aa-like蛋白编码基因vip3aam，btbv基因以及两个蛋白先后顺序相反的btbvr基因的植物表达载体，分别命名为：pcambia3301-cry1abm、pcambia3301-vip3aam、pcambia3301-btbv和pcambia3301-btbvr，其载体图谱如图6所示。
[0083]
2)利用冻融法将上述植物表达载体转化到农杆菌eha105中，并作为遗传转化的工程菌，对玉米胚芽鞘进行农杆菌介导的瞬时遗传转化，利用商业化的cry1ab和vip3aa抗体进行elisa检测，不同载体在玉米胚芽鞘中表达水平。
[0084]
结果如图7所示，lp4/2a自剪切肽介导的两个杀虫蛋白共表达，显然较单独表达任意一个蛋白均会有所下降，而且两种蛋白先后次序也会影响蛋白表达量。其中，本发明所述的btbv基因所表达的杀虫蛋白表达量最高。同时，通过简单的将两个蛋白编码基因通过lp4/2a蛋白编码序列进行连接获得的btbvr基因中，编码的同样两种蛋白表达量总和尚未
达到单独一种杀虫蛋白编码基因的表达水平。
[0085]
实施例3
[0086]
智能设计btbv基因对四种主要玉米鳞翅目害虫的抗性
[0087]
为测试btbv及其衍生基因在玉米细胞中的表达产物对玉米主要害虫(亚洲玉米螟、草地贪夜蛾、玉米粘虫、棉铃虫)的杀虫能力。分别将实施例2中利用农杆菌介导的瞬时转化获得的含有杀虫蛋白的玉米组织作为饲料，以常规非转基因玉米作为对照(ck)。
[0088]
1)对亚洲玉米螟的毒性
[0089]
取适量转基因玉米组织，疏松置于养虫盒底部(养虫盒底部和顶部分别用湿润的滤纸保湿)，接入20头孵化24小时的幼虫。每盒为1个处理，每个处理5次重复。放置在温度28℃、光周期16h:8h(l:d)、相对湿度80％的人工气候培养箱中培养。隔天更换相同来源的新鲜玉米组织，并调查、记录存活幼虫数量。同时，保持滤纸湿润。
[0090]
表7对亚洲玉米螟幼虫的毒性
[0091][0092]
注：1、表中数据为平均值
±
标准误差。
[0093]
2、表中同列的不同字母表示不同材料间具有显著性差异(p《0.05)。
[0094]
试验结果如表7所示，尽管全部4个供试基因的瞬时转化玉米细胞组织中积累的杀虫蛋白均对亚洲玉米螟具有杀虫活性，但是显然btbv与cry1abm表达产物对亚洲玉米螟的毒性最强。虽然btbv和btbvr所表达的杀虫蛋白种类完全相同，但两者由实施例4所展示的蛋白表达量的显著差异导致btbvr瞬时转化玉米胚芽鞘组织杀虫效果较btbv低得多。同时，瞬时转化的玉米组织中cry1abm编码蛋白cry1ab-like不仅表达量要较vip3aam基因编码的vip3aa-like蛋白要多，其对玉米螟的杀虫针对性也更明显。
[0095]
2)对草地贪夜蛾的毒性
[0096]
取适量转基因玉米组织，疏松置于养虫盒底部(养虫盒底部和顶部分别用湿润的滤纸保湿)，接入20头孵化24小时的幼虫。每盒为1个处理，每个处理5次重复。放置在温度28℃、光周期16h:8h(l:d)、相对湿度80％的人工气候培养箱中培养。隔天更换相同来源的新鲜玉米组织，并调查、记录存活幼虫数量。同时，保持滤纸湿润。
[0097]
表8对草地贪夜蛾幼虫的毒性
[0098][0099]
注：1、表中数据为平均值
±
标准误差。
[0100]
2、表中同列的不同字母表示不同材料间具有显著性差异(p《0.05)。
[0101]
试验结果如表8所示，尽管全部4个供试基因的瞬时转化玉米细胞组织中积累的杀虫蛋白均对草地贪夜蛾具有杀虫活性，但是显然btbv较其他三个基因赋予玉米转基因组织对草地贪夜蛾最强的毒性。因此，虽然btbv中两种杀虫蛋白的表达量均低于单独表达，但两者同时存在仍能形成毒性叠加效应。
[0102]
3)对玉米粘虫的毒性
[0103]
取适量转基因玉米组织，疏松置于养虫盒底部(养虫盒底部和顶部分别用湿润的滤纸保湿)，接入20头孵化24小时的幼虫。每盒为1个处理，每个处理5次重复。放置在温度28℃、光周期16h:8h(l:d)、相对湿度80％的人工气候培养箱中培养。隔天更换相同来源的新鲜玉米组织，并调查、记录存活幼虫数量。同时，保持滤纸湿润。
[0104]
表9对玉米粘虫幼虫的毒性
[0105][0106]
注：1、表中数据为平均值
±
标准误差。
[0107]
2、表中同列的不同字母表示不同材料间具有显著性差异(p《0.05)。
[0108]
试验结果如表9所示，尽管全部4个供试基因的瞬时转化玉米细胞组织中积累的杀虫蛋白均对玉米粘虫具有杀虫活性，但是单独一种杀虫蛋白的转基因玉米组织明显不如btbv基因赋予受体玉米组织的对玉米粘虫的高杀虫活力，尽管btbvr中两种表达量总和较单独表达一种蛋白的表达水平还低得多，但仍能通过叠加作用获得近似的杀虫效果。
[0109]
4)对棉铃虫的毒性
[0110]
取适量玉米组织，疏松置于养虫盒底部(养虫盒底部和顶部分别用湿润的滤纸保湿)，接入20头孵化24小时的幼虫。每盒为1个处理，每个处理5次重复。放置在温度28℃、光周期16h:8h(l:d)、相对湿度80％的人工气候培养箱中培养。隔天更换相同来源的新鲜玉米组织，并调查、记录存活幼虫数量。同时，保持滤纸湿润。
[0111]
表10对棉铃虫幼虫的毒性
[0112][0113]
注：1、表中数据为平均值
±
标准误差。
[0114]
2、表中同列的不同字母表示不同材料间具有显著性差异(p《0.05)。
[0115]
试验结果如表10所示，尽管全部4个供试基因的瞬时转化玉米细胞组织中积累的杀虫蛋白均对棉铃虫具有杀虫活性，但是显然btbv表达产物对棉铃虫的毒性最强。
[0116]
本发明人工设计合成的杀虫基因btbv，可同时表达两种不同类型的经典杀虫蛋白，使其具备了单独使用一种杀虫蛋白无法具有的杀虫能力，对玉米主要害虫亚洲玉米螟、草地贪夜蛾、玉米粘虫、棉铃虫同时具备更高效的杀虫能力。同时，对比结果表明，btbv高剂量表达杀虫蛋白的能力，是经过文库筛选获得的最优组合与设计，仅仅简单设计的方式获得的btbvr基因，因表达量严重不足，在杀虫能力方面远远不及。
[0117]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。