一种淡紫拟青霉菌、菌剂及其制备方法

1.本发明属于微生物肥料技术领域，具体涉及一种淡紫拟青霉菌、菌剂及其制备方法。


背景技术：

2.利用天然微生物制备微生物菌剂、菌肥的技术是上世纪中末期在国际上迅速发展起来的一项绿色环保的生物处理技术。它通过多学科的综合运用，借助于混合的微生物群落在特定的环境中对多相的有机物进行分解，将有机固态废弃物发酵腐熟成为腐殖酸。该技术用于肥沃和改良土壤，具有经济、实用、不产生二次污染的特点，因此受到了广泛关注。然而，由于微生物菌剂、菌肥制备看似简单，造成目前国内农户个体或者小微型企业纷纷量产，而且一般在生产过程中对微生物菌种菌株、原料都不进行筛选、调理，直接堆积发酵，其结果是发酵周期长、生产效率低下、杂菌数量多甚至包含大量的有害致病菌，目标有益菌不明确并且目标有益菌使用或货架存活率低，严重影响产品的质量及用户安全。
3.淡紫拟青霉是一种在土壤中常见的有效寄生菌，对多种线虫都有防治效能，其寄主有根结线虫、胞囊线虫、金色线虫、异皮线虫，是最有前途的生防制剂，具有高效、广谱、长效、安全、无污染、无残留等特点。在植物根系周围施用淡紫拟青霉菌剂，能促进植物根系及植株营养器官的生长，同时对土壤中的线虫有较好的抑制、杀灭作用并提高作物的抗病力。因此，将其开发为安全、环保的微生物菌剂、菌肥，具有广泛的应用前景和良好的经济与社会效益。但是，目前淡紫拟青霉菌剂具有发酵周期长、货架期短，与其它菌种复合使用容易产生拮抗作用等缺点。
4.此外，现有技术中缺乏简单有效的方法可以用于活性高、抗拮抗作用强等农业有益菌种的筛选。


技术实现要素：

5.为解决现有技术中菌剂发酵周期长、生产效率低下、杂菌数量多、货架存活率低等缺陷，本发明提供了一种淡紫拟青霉菌、其菌剂及其制备方法。
6.本发明第一方面提供了一种淡紫拟青霉菌(paecilomyces lilacinus)pm0327-3，其中，所述淡紫拟青霉菌(paecilomyces lilacinus)pm0327-3的保藏编号为gdmcc no：62375。
7.所述(paecilomyces lilacinus)pm0327-3具有耐代谢物拮抗、耐高温和耐酸耐碱能力，具有较好的应用前景。
8.本发明第二方面提供了采用如本发明第一方面所述的淡紫拟青霉菌(paecilomyces lilacinus)pm0327-3发酵得到的发酵产物。
9.本发明第三方面提供了如本发明第一方面所述的淡紫拟青霉菌(paecilomyces lilacinus)pm0327-3或如本发明第二方面所述的发酵产物在微生物肥料中的应用。
10.本发明第四方面提供了一种微生物肥料，所述微生物肥料包括本发明第一方面所
述的淡紫拟青霉菌(paecilomyces lilacinus)pm0327-3和/或本发明第二方面所述的发酵产物。
11.可选地，所述微生物肥料包括微生物接种剂(菌剂)、复合微生物肥料和生物有机肥中的任一种。
12.本发明第五方面提供了本发明第四方面所述的微生物肥料的制备方法，其包括以下步骤：
13.加入淡紫拟青霉菌(paecilomyces lilacinus)pm0327-3种子液并进行深层发酵得到发酵液，所述发酵液进一步经过固态发酵，干燥，获得所述微生物肥料。
14.本发明第六方面提供了一种代谢物浓缩液混合物，所述代谢物浓缩液混合物由淡紫拟青霉菌深层发酵液的滤液浓缩液、地衣芽孢杆菌深层发酵液的滤液浓缩液、枯草芽孢杆菌深层发酵液的滤液浓缩液组成。
15.本技术对淡紫拟青霉菌、地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌不进行限定，在一些优选方案中，所述淡紫拟青霉菌为淡紫拟青霉菌cicc 40276；所述地衣芽孢杆菌为地衣芽孢杆菌cicc 10037；所述枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌cmcc 63501。
16.可选地，所述淡紫拟青霉菌深层发酵液为淡紫拟青霉菌深层发酵至活菌数≥15亿cfu/ml时的发酵液；
17.所述地衣芽孢杆菌深层发酵液为地衣芽孢杆菌深层发酵至活菌数≥60亿cfu/ml时的发酵液；
18.所述枯草芽孢杆菌深层发酵液为枯草芽孢杆菌深层发酵至活菌数≥75亿cfu/ml时的发酵液。
19.可选地，所述淡紫拟青霉菌深层发酵液的滤液浓缩液为淡紫拟青霉菌发酵液的过滤液浓缩了3倍以上的液体；
20.所述地衣芽孢杆菌深层发酵液的滤液浓缩液为地衣芽孢杆菌发酵液的过滤液浓缩了3倍以上的液体；
21.所述枯草芽孢杆菌深层发酵液的滤液浓缩液为枯草芽孢杆菌发酵液的过滤液浓缩了3倍以上的液体。
22.本发明第七方面提供了如本发明第六方面所述的代谢物浓缩液混合物的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
23.深层发酵获得淡紫拟青霉菌深层发酵液，过滤，滤液浓缩；
24.深层发酵获得枯草芽孢杆菌深层发酵液，过滤，滤液浓缩；
25.深层发酵获得地衣芽孢杆菌深层发酵液，过滤，滤液浓缩；
26.将滤液浓缩得到的三种浓缩液混合，得到所述代谢物浓缩液混合物。
27.本发明第八方面提供了如本发明第六方面所述的代谢物浓缩液混合物或根据本发明第七方面所述的方法得到的代谢物浓缩液混合物在筛选耐代谢物拮抗菌株，或在制备用于筛选耐代谢物拮抗菌株产品中的应用。
28.本发明第九方面提供了一种菌株的选育方法，所述选育方法使用如本发明第六方面所述的代谢物浓缩液混合物或根据本发明第七方面所述的方法得到的代谢物浓缩液混合物进行选育。
29.可选地，所述选育方法包含以下步骤：
30.(1)将出发菌株与代谢物浓缩液混合物混合，35-70℃处理5-40min，涂平板筛选得到耐代谢物拮抗且耐温的菌株。
31.可选地，所述选育方法还包含以下步骤：
32.(2)将筛选得到的耐代谢物拮抗且耐温的菌株在耐酸培养基和/或耐碱培养基上进一步筛选，得到耐代谢物拮抗、耐温，且耐酸和/或耐碱的菌株。
33.可选地，所述出发菌株选自淡紫拟青霉菌、地衣芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌中的任意一种。
34.在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。如非特别指明，本发明所用试剂和原料市售可得。
35.本发明的积极进步效果在于：
36.1、本技术所提供的淡紫拟青霉菌株(paecilomyces lilacinus)pm0327-3，不受淡紫拟青霉、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌发酵代谢物拮抗且耐温耐酸耐碱。
37.2、本技术所提供的淡紫拟青霉(paecilomyces lilacinus)pm0327-3生产活性高，深层发酵+固态发酵产生的菌落数比对照菌株淡紫拟青霉(paecilomyces lilacinus)cicc 40276提高40％以上。
38.3、本技术所提供的淡紫拟青霉(paecilomyces lilacinus)pm0327-3复苏率高，商品货架条件下保藏一年存活率(复苏率)比对照提高近20％。
39.4、本技术所提供的淡紫拟青霉(paecilomyces lilacinus)pm0327-3不受淡紫拟青霉、枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌代谢产物混合物的拮抗作用，与枯草芽孢杆菌和/或地衣芽孢杆菌复合使用，有利于与枯草芽孢杆菌和/或地衣芽孢杆菌形成共存优势菌群，有益于快速定向营造人为需要的有益于所需植物生长的优势微生态环境，阻碍并抑制病原微生物的生长繁殖，分解降解土壤中的化学物质，增加土壤团粒结构，增加土壤透气性，该优势微生态环境将产生大量抑菌杀菌物质、防治土传病害，减少植物病害、促进植物生长、绿色环保、增产减碳。
40.5、本技术所提供的代谢物浓缩液混合物，含有淡紫拟青霉菌(paecilomyces lilacinus)、地衣芽孢杆菌(bacillus licheniformis)和枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)三种菌的发酵液的滤液浓缩液，可用于选育具有耐淡紫拟青霉菌、地衣芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌代谢物拮抗的菌株。
41.6、本技术所提供的菌株选育方法，通过使用代谢物浓缩液混合物和高温筛选的方法，可以选育出具有耐代谢物拮抗且耐高温的菌株，进一步采用耐酸、耐碱培养基选育，可以提高菌株的耐酸、耐碱性。
42.生物材料保藏信息
43.淡紫拟青霉菌(paecilomyces lilacinus)pm0327-3，已于2022年4月12日保藏在广东省微生物菌种保藏中心(gdmcc)，保藏地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编：510070，保藏编号为：gdmcc no：62375，培养物名称是pm0327-3，分类命名是淡紫拟青霉菌(paecilomyces lilacinus)。
具体实施方式
44.出于本发明的目的，除非另外说明，本技术所使用的术语具有以下含义：
45.术语“深层发酵”，即液态发酵，是指菌种接入液体发酵培养基，持续通入无菌空气并搅拌的一种发酵方式。
46.术语“固态发酵”是指在没有或极少量自由水存在的情况下，在有一定湿度的固态基质中，进行的一种或多种微生物的生物反应过程。
47.术语“微生物肥料”是指含有特定微生物活体的制品，应用于农业生产，通过其中所含微生物的生命活动，增加植物养分的供应量或促进植物生长，提高产量，改善农产品品质及农业生态环境，目前，微生物肥料包括微生物接种剂(菌剂)、复合微生物肥料和生物有机肥。
48.其中，微生物接种剂(菌剂)是指一种或一种以上的目的微生物经工业化生产增殖后直接使用，或经浓缩、干燥或经载体吸附而制成的活菌制品，包括：
49.单一菌剂：由一种微生物菌种制成的微生物接种剂；
50.复合菌剂：由两种或两种以上且互不拮抗的微生物菌种制成的微生物接种剂；
51.有机物料腐熟菌剂：能加速各种有机物料(包括作物秸秆、畜禽粪便、生活垃圾及城市污泥等)分解、腐熟的微生物接种剂；
52.生物修复菌剂：能通过微生物的生长代谢活动，使环境中的有害物质浓度减少、毒性降低或无害化的微生物接种剂。
53.复合微生物肥料是指目的微生物经工业化生产增殖后与营养物质复合而成的活菌制品。
54.生物有机肥是指目的微生物经工业化生产增殖后与主要以动植物残体(如畜禽粪便、农作物秸秆等)为来源并经无害化处理的有机物料复合而成的活菌制品。
55.术语“cfu”是指菌落形成单位(cfu,colony forming units)，是指在琼脂平板上经过一定温度和时间培养后形成的每一个菌落。
56.下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。
57.在一种实施方案中，本发明所提供的菌剂中，淡紫拟青霉菌(paecilomyces lilacinus)pm0327-3的含量≥120亿cfu/g，例如为125-180亿cfu/g，优选135-150亿cfu/g。
58.在一种实施方案中，本发明所提供的菌剂的制备方法包括以下步骤：加入淡紫拟青霉菌(paecilomyces lilacinus)pm0327-3种子液并进行深层发酵得到发酵液，所述发酵液进一步经过固态发酵，干燥，获得所述菌剂。
59.可选地，深层发酵(即液态发酵)采用的培养基包括以下组分：
60.[0061][0062]
ph值6.0-7.0。
[0063]
可选地，所述深层发酵(即液态发酵)的条件满足以下至少一种：
[0064]
种子液的接种量为5-10％；
[0065]
种子液中活菌数≥10亿cfu/ml，例如为10-20亿cfu/ml；
[0066]
培养温度为25-32℃；
[0067]
培养周期为120-160小时；
[0068]
通气量为(0.8-1.2):1v/vm；
[0069]
搅拌转速200-500rpm。
[0070]
可选地，所述固态发酵在固态发酵培养基中进行，所述固态发酵培养基包括以下组分：
[0071][0072]
可选地，所述固态发酵的条件满足以下至少一种：
[0073]
接种量为5-10％；
[0074]
先在温度为25-32℃、相对湿度为80-95％条件下培养4-6天；然后将温度调整为32-35℃，培养3-5天。
[0075]
可选地，所述干燥的条件为：
[0076]
送风温度：25-32℃；
[0077]
相对湿度：≤35％，例如为10-20％；
[0078]
送风气流干燥时间为5-7天。
[0079]
在一种实施方案中，本发明所提供的代谢物浓缩液混合物包括淡紫拟青霉菌深层发酵液的滤液浓缩液、地衣芽孢杆菌深层发酵液的滤液浓缩液、枯草芽孢杆菌深层发酵液的滤液浓缩液。
[0080]
在一些优选方案中，地衣芽孢杆菌为地衣芽孢杆菌cicc 10037；淡紫拟青霉菌为淡紫拟青霉菌cicc 40276；枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌cmcc63501。
[0081]
可选地，所述淡紫拟青霉菌深层发酵液为淡紫拟青霉菌深层发酵至活菌数≥15亿cfu/ml时的发酵液；优选活菌数≥20亿cfu/ml时的发酵液或活菌数≥30亿cfu/ml时的发酵液、活菌数15-60亿cfu/ml时的发酵液、活菌数20-50亿cfu/ml时的发酵液或活菌数30-50亿cfu/ml时的发酵液。
[0082]
可选地，所述地衣芽孢杆菌深层发酵液为地衣芽孢杆菌深层发酵至活菌数≥60亿cfu/ml时的发酵液；优选活菌数≥90亿cfu/ml时的发酵液或活菌数≥120亿cfu/ml时的发酵液；优选活菌数60-180亿cfu/ml时的发酵液、活菌数90-150亿cfu/ml时的发酵液或活菌数120-150亿cfu/ml时的发酵液。
[0083]
可选地，所述枯草芽孢杆菌深层发酵液为枯草芽孢杆菌深层发酵至活菌数≥75亿cfu/ml时的发酵液；优选活菌数≥100亿cfu/ml时的发酵液、活菌数≥120亿cfu/ml时的发酵液或活菌数≥150亿cfu/ml时的发酵液；优选活菌数75-200亿cfu/ml时的发酵液、活菌数120-180亿cfu/ml时的发酵液或活菌数150-180亿cfu/ml时的发酵液。
[0084]
可选地，所述淡紫拟青霉菌深层发酵液的滤液浓缩液为淡紫拟青霉菌发酵液的过滤液浓缩了3倍以上的液体，优选浓缩4倍以上或浓缩6倍以上；优选浓缩3-10倍、浓缩4-8倍、浓缩4-9倍或浓缩5-8倍。
[0085]
可选地，所述地衣芽孢杆菌深层发酵液的滤液浓缩液为地衣芽孢杆菌发酵液的过滤液浓缩了3倍以上的液体，优选浓缩4倍以上或浓缩6倍以上；优选浓缩3-10倍、浓缩4-8倍、浓缩4-9倍或浓缩5-8倍。
[0086]
可选地，所述枯草芽孢杆菌深层发酵液的滤液浓缩液为枯草芽孢杆菌发酵液的过滤液浓缩了3倍以上的液体，优选浓缩4倍以上或浓缩6倍以上；优选浓缩3-10倍、浓缩4-8倍、浓缩4-9倍或浓缩5-8倍。
[0087]
在一种实施方案中，本技术所提供的菌株的选育方法包含以下步骤：
[0088]
(1)将出发菌株与代谢物浓缩液混合物混合，35-70℃处理5-40min，涂平板筛选得到耐代谢物拮抗且耐热的菌株。
[0089]
可选地，所述选育方法还包含以下步骤：
[0090]
(2)将筛选得到的耐代谢物拮抗且耐热的菌株在耐酸培养基和/或耐碱培养基上进一步筛选，得到耐代谢物拮抗、耐热，且耐酸和/或耐碱的菌株。
[0091]
可选地，所述耐酸培养的ph为3-6；优选ph为4-5。
[0092]
所述耐碱培养基的ph值为8-11，优选ph为9-10。
[0093]
下面结合本发明的具体操作方法来说明压力选择筛选选育不受上述枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌发酵代谢物拮抗且耐酸耐碱的淡紫拟青霉菌株及该菌株产业化生产应用，对本发明做进一步的阐述，提供的实施例仅仅用于对本发明的进一步阐述，而不构成对本发明范围的任何限制。
[0094]
实施例1
[0095]
代谢物浓缩液混合物制备：
[0096]
1、淡紫拟青霉深层发酵液滤液浓缩液的制备：
[0097]
1.1、生产菌株：淡紫拟青霉(paecilomyces lilacinus)cicc 40276；
[0098]
1.2、发酵罐发酵培养：
[0099]
1.2.1、发酵培养基(wt％)：土豆6.0，玉米浆3.0，黄豆粉3.0，葡萄糖2.0，玉米粉
1.5，玉米淀粉1.5，大米粉3.0，余量为水，ph值6.5。
[0100]
1.2.2、发酵培养条件：接种量10％，发酵温度28
±
1℃，发酵周期150h，中间过程流加补料，确保还原糖为1.1
±
0.2％，转速350rpm，通气量(0.8-1.2):1v/vm，控制发酵罐内发酵液的溶解氧60-70％之间，控制ph6.8-7.2，放罐测定发酵液活菌数30亿cfu/ml。
[0101]
1.3、发酵液滤液浓缩液制备：发酵液过滤，滤液浓缩6倍，得到发酵液滤液浓缩液，4-6℃冰箱保藏。
[0102]
2、地衣芽孢杆菌深层发酵发酵液滤液浓缩液的制备：
[0103]
2.1、生产菌株：地衣芽孢杆菌(bacillus licheniformis)cicc 10037；
[0104]
2.2、发酵罐发酵培养：
[0105]
2.2.1、发酵培养基(wt％)：葡萄糖2，玉米浆1.0，酵母浸膏0.5，豆粕3.0，牛肉浸膏0.5，玉米淀粉2.0，氯化钠0.3，磷酸二氢钾0.2，磷酸氢二钾0.3，硫酸镁0.05，硫酸铵0.15，硫酸锰0.03，轻质碳酸钙0.3，余量为水，调节ph7.2。
[0106]
2.2.2、发酵培养条件：接种量5％，发酵温度32℃，周期为84h，中间过程流加补料，确保还原糖为1.1
±
0.2％，转速450rpm，通气量为(1.0
±
0.2):1v/vm，控制发酵罐内发酵液的溶解氧为60
±
5％，控制ph为7.5
±
1.0，放罐测定发酵液活菌数120亿cfu/ml。
[0107]
2.3、发酵液滤液浓缩液制备：发酵液陶瓷膜过滤，滤液浓缩6倍，得到发酵液滤液浓缩液，4-6℃冰箱保藏。
[0108]
3、枯草芽孢杆菌深层发酵发酵液滤液浓缩液的制备：
[0109]
3.1、生产菌株：枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)cmcc 63501；
[0110]
3.2、发酵罐发酵培养：
[0111]
3.2.1、发酵培养基(wt％)：葡萄糖2，大豆蛋白胨1.5，安琪酵母粉2.0，豆粕2.0，牛肉浸膏2.0，玉米淀粉2.0，氯化钠0.3，磷酸二氢钾0.2，硫酸镁0.05，硫酸铵0.15，硫酸锰0.03，轻质碳酸钙0.3，余量为水，调节ph7.2。
[0112]
3.2.2、发酵培养条件：接种量5％，发酵温度为35℃，周期为84h，中间过程流加补料，确保还原糖为1.1
±
0.2％，转速为500rp，通气量为(1.0
±
0.2):1v/vm，控制发酵罐内发酵液的溶解氧为60
±
5％，控制ph7.5
±
1.0，放罐测定发酵液活菌数150亿cfu/ml。
[0113]
3.3、发酵液滤液浓缩液制备：发酵液陶瓷膜过滤，过滤液浓缩6倍，得到发酵液滤液浓缩液，4-6℃冰箱保藏。
[0114]
4、代谢物浓缩液混合物制备：
[0115]
取上述分别都浓缩了6倍的枯草芽孢杆菌发酵液过滤液的浓缩液、地衣芽孢杆菌发酵液过滤液的浓缩液、淡紫拟青霉发酵液过滤液的浓缩液等比例混合均匀，除菌过滤器过滤，得到代谢物浓缩液混合物。
[0116]
实施例2
[0117]
优势淡紫拟青霉菌(paecilomyces lilacinus)的选育：
[0118]
1、以淡紫拟青霉(paecilomyces lilacinus)cicc 40276作为出发菌株，选育不受实施例1制备的代谢物浓缩液混合物拮抗，耐温、耐酸且耐碱的淡紫拟青霉菌株。
[0119]
1.1、淡紫拟青霉(paecilomyces lilacinus)cicc 40276斜面制备：制备pda培养基斜面；以淡紫拟青霉(paecilomyces lilacinus)cicc 40276接种该斜面，该接种斜面置于29℃培养180h。
[0120]
1.2、淡紫拟青霉(paecilomyces lilacinus)cicc 40276斜面菌液制备：取上述代谢物浓缩液混合物5ml，加入上述的淡紫拟青霉成熟斜面，刮洗下菌苔，充分分散菌苔成单菌落。
[0121]
1.3、耐温菌液制备：吸取1ml上述斜面菌液，加入9ml代谢物浓缩液混合物形成10-1
稀释度的样品，于35℃恒温水浴箱保藏30min。
[0122]
1.4、平板分离选育菌株：
[0123]
1.4.1、平板培养基：将pda培养基制成双碟平板。
[0124]
1.4.2、耐受代谢物浓缩液混合物菌株的选育：从置于35℃恒温水浴箱的10-1
稀释度的试管中以0分钟、5分钟、10分钟、15分钟、20分钟、25分钟和30分钟分别取样，并用代谢物浓缩液混合物进一步稀释得到10-2
至10-9
的样品。
[0125]
1.4.3、耐受代谢物浓缩液混合物的稀释液涂布：分别取上述稀释度10-3
至10-9
的样品1ml涂布于双碟平板，于29℃培养180h。
[0126]
1.4.4、耐温及耐拮抗平板菌落选育：
[0127][0128]
1.4.5、耐酸、耐碱平板菌落选育：
[0129]
1.4.5.1、挑选上述耐拮抗且耐35℃温度10分钟(稀释度10-5
)、15分钟(稀释度10-4
)和20分钟(稀释度10-4
)的三个菌落(分别标记为t10、t15和t20)进一步进行耐酸菌落选育、耐碱菌落选育：
[0130]
①
耐酸培养基平板：将pda培养基ph调整为4.5，制成分离双碟平板。
[0131]
②
耐碱培养基平板：将pda培养基ph调整为ph为9.5，制成分离双碟平板。
[0132]
1.4.5.2、将t10、t15和t20三株菌株分别涂布在耐酸培养基平板29℃培养180h，各挑取1株耐酸菌株分别标识为st10、st15和st20。将st10、st15和st20三株菌株分别涂布在耐碱培养基平板29℃培养180h，各挑取1株耐酸又耐碱菌株分别标识为nst10、nst15和nst20。
[0133]
2、沙土管保藏菌株：
[0134]
将nst10、nst15和nst20三株淡紫拟青霉菌株分别制成菌悬液，添加到沙土管，沙土管标识好对应的菌号，时间。沙土管经过真空干燥，用牛皮纸包好，放置干燥器内再放4-6
℃冰箱保藏。
[0135]
实施例3
[0136]
稳定性试验：
[0137]
1、将经过沙土管保藏60天的nst10、nst15和nst20三株淡紫拟青霉菌株各取一只沙土管，以出发菌株淡紫拟青霉(paecilomyces lilacinus)cicc 40276为对照，进行摇瓶发酵培养验证其稳定性。
[0138]
1.1、摇瓶种子培养基(wt％)：土豆15，玉米浆5，黄豆粉5，葡萄糖3，余量为水，ph自然。
[0139]
250ml三角瓶中，装量25ml挖块接种，于200r/min转速的摇床上振荡，28
±
1℃培养4-5天，液体摇瓶发酵活菌数20亿cfu/ml左右。
[0140]
1.2、摇瓶发酵培养基(wt％)：土豆8，玉米浆4，黄豆粉3，葡萄糖2，玉米粉1，玉米淀粉2，余量为水，调节ph为6.5。
[0141]
第一组摇瓶发酵条件：500ml三角瓶中，加入40ml摇瓶发酵培养基，5ml代谢物浓缩液混合物，接种量5ml，于200r/min转速的摇床上振荡，28
±
1℃培养120h，每组3个摇瓶。
[0142]
第二组摇瓶发酵条件：500ml三角瓶中，加入45ml摇瓶发酵培养基，接种量5ml，于200r/min转速的摇床上振荡，28
±
1℃培养120h，每组3个摇瓶。
[0143]
2、每组3个摇瓶验证的平均数据如下：
[0144][0145]
由上述结果可以看出，经过沙土管保藏60天后，nst10、nst15和nst20三株淡紫拟青霉菌株摇瓶培养菌落的数量均高于对照组的出发菌cicc40276。由此可见，nst10、nst15和nst20具有较高的稳定性，并且其生长几乎不受枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和淡紫拟青霉发酵产物的拮抗，而cicc 40276对照菌株在含有代谢物浓缩液混合物的培养基中生长活力明显低于不含代谢物浓缩液混合物的培养基。其中，nst20表现最佳。
[0146]
实施例4
[0147]
1、生产验证：
[0148]
取经过稳定性试验的nst10、nst15和nst20菌株各一只淡紫拟青霉沙土管，以出发菌株淡紫拟青霉(paecilomyces lilacinus)cicc 40276为对照菌株进行生产验证。
[0149]
1.1、发酵罐培养：培养基为(wt％)土豆6，玉米浆3，黄豆粉3，葡萄糖2，玉米粉1.5，玉米淀粉1.5，大米粉3，余量为水，ph值6.5。种子液(种子液中活菌数为10亿cfu/ml)接种量10％，28
±
1℃，培养120小时，通气量1:1v/vm，搅拌转速200rpm。菌落数达30亿cfu/ml。
[0150]
1.2、固态发酵培养基(wt％)：大米58.0，麸皮5.0，米糠6.0，黄豆粉3.0，余量为水。
大米用加热至60℃的三种菌株的发酵液过滤液的浓缩液(代谢物浓缩液混合物)混合物浸泡1h，捞起晾干，加入麸皮、黄豆粉、米糠、水，混合搅拌均匀。灭菌。
[0151]
1.3、固态发酵的培养条件：接种量10％，温度28
±
1℃，相对湿度90
±
2％，培养5天(第三天至第五天补加红糖水，保持培养盘面上纱布湿润)，温度调整为33
±
1℃，继续培养4天，大部分菌丝体转为淡紫红色。
[0152]
1.4、干燥空气常温气流干燥：温度30
±
1℃，相对湿度20％，送风气流干燥6天。使得固体培养物水分≤5％。干燥后固体培养物经过30目筛过筛，获得筛过物淡紫拟青霉孢子粉(菌剂)；筛余物粉碎过30目筛。
[0153]
1.5、固态发酵生产数据：
[0154]
菌株cicc 40276对照nst10nst15nst20筛过物菌落数(亿cfu/g)98130125138筛余物菌落数(亿cfu/g)5.28.37.68.8水分(％)3.43.33.23.3
[0155]
由上述结果可以看出，nst10、nst15和nst20的筛过物、筛余物菌落数均高于对照组的出发菌cicc 40276。可见nst10、nst15和nst20在代谢物浓缩液混合物条件下仍具有较高的生产活力，与对照组cicc 40276相比，菌落数均提高了27％以上。并且，nst20菌落数最高，与对照组相比，菌落数提高了40％以上。
[0156]
实施例5
[0157]
商品货架稳定性试验：
[0158]
1、实施例4生产得到的淡紫拟青霉各菌号产品(筛过物)的包装都采用铝塑真空包装，每袋1000g，在温度20℃、相对湿度60％、非阳光直射的条件下存储，进行每3个月一次为期12个月的数据检测。
[0159]
2、货架稳定性数据如下：
[0160][0161]
由上述结果可以看出，nst10、nst15和nst20在为期12个月的检测后，菌存活率(即复苏率)均高于对照组的出发菌cicc 40276，高于对照组10％以上。可见nst10、nst15和nst20具有较高的商品货架稳定性，其中在相同条件下，nst20的活菌数下降最慢，菌存活率高于对照组近20％。
[0162]
将表现最优秀的淡紫拟青霉nst20菌株命名为淡紫拟青霉(paecilomyces lilacinus)pm0327-3并送广东省微生物菌种保藏中心(广东省科学院微生物研究所)保藏。
[0163]
以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，并非用来限定本发明实施的范围，故但凡依本发明的权利要求和说明书所做的变化或修饰，皆应属于本发明专利涵盖的范围之内。