一种DHA藻粉的制备方法及产品和应用与流程

本发明属于生物，具体涉及一种dha藻粉的制备方法及产品和应用。

背景技术：

1、海洋藻类资源丰富，主要分为红藻、绿藻、褐藻及微藻。由于微藻种类多、数量大、分布范围广，在整个海洋生态系统中发挥着积极作用。由于海洋其高盐、高压、低温、低营养、低光照等极端特征和始终处于流动状态的独特水体环境，迫使有些海洋生物必须具备相应的粘附结构或黏性物质，以保证有一个相对稳定的生态环境。

2、二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid)，简称dha，分子式为c22h32o2，是一种长链omega-3多不饱和脂肪酸。裂壶藻(schizochytrium limacinum)，又名裂殖壶菌，属于水霉目、破囊壶菌科类藻的海洋真菌。破囊壶菌是嗜腐败微生物，占腐烂褐藻中微生物总数的30％。该菌广泛存在于有机物丰富和盐度高的环境中，海水中含量达2.1×103-4.1×104个/l，尤其在富含有机物的红树林中，其生物量更大。裂殖壶菌中含有的dha是人体所必需的多不饱和脂肪酸，因裂殖壶菌生长不受季节的影响，具有对环境无污染、营养成分稳定等诸多优点，已成为发酵生产dha的理想菌种。裂殖壶菌是一种理想的水产和禽畜饵料的添加剂，其安全性已经得到美国食品和药品局(food and drug administration)的认可。研究表明，用裂殖壶菌干粉喂养鱼、虾、贝类，能提高其幼体的免疫力，增加成活率；并对其幼体的生长具有明显的促进作用。在禽畜的饲料中添加裂殖壶菌菌粉，可以提高禽畜产品肉、蛋、奶中dha的含量。

3、这类微藻在发酵产生dha的同时，会分泌出大量的多糖类物质，这类多糖或多糖复合物存在于细胞壁外，易与菌体分离，被称为胞外多糖(eps)，eps由连续的寡糖单元组成，寡糖单元含半乳糖73-85％，葡萄糖5.5-8.5％，甘露糖2.5-8％，鼠李糖2-6％，岩藻糖1.5-3.8％和木糖1.2-2.50％。采用hpgpc法可检测sp1、sp2、sp3、sp4四种多糖组分，分子量依次为43kda、1494kda、473kda、1625kda。sp1中主要含有d-葡萄糖﹑d-甘露糖和半乳糖；sp2中含有d-甘露糖、d-艾杜糖、半乳糖、d葡萄糖中的两种；sp3﹑sp4组成类似，含有d-甘露糖，艾杜糖，半乳糖。

4、这些胞外多糖会造成发酵液的粘度增大、最大溶氧量急剧下降，从而对发酵的进程造成一定的影响，因此，这些胞外多糖常常被作为副产物而舍弃。在实际应用中，尤其是在藻粉的制备过程中，裂殖壶菌发酵液含有大量胞外多糖，多糖的黏性特性会造成喷雾干燥过程的黏壁、堵塞等现象，这不仅造成产品的大量损失，也会影响产品的质量。

5、cn103204951b介绍了裂殖壶藻胞外多糖的分离纯化方法。包括以下步骤：1)以裂殖壶菌发酵液为原料，用乙醇沉淀发酵液中多糖，有机溶剂清洗不溶物，再用去离子水溶解不溶物，三氣乙酸法去除蛋白，再次使用乙醇沉淀得多糖粗品，使用去离子水为溶媒，配制成待分级溶液；2)将步骤1)配制成的待分级溶液经快流速纤维素琼脂糖凝胶阴离子交换树脂梯度洗脱分管收集，硫酸苯酚法测定各管多糖浓度，绘制洗脱曲线，将收集的各个部分合并，浓缩，经透析膜出去小分子杂质，冻干后即得分离纯化的裂殖壶藻胞外多糖。操作简便、高效，适用于大规模工业生产，获得多糖性质专生理活性高。

6、cn105685766b利用裂殖壶藻菌株发酵制备了一种胞外多糖的组合物，以该胞外多糖的摩尔百分比计，该胞外多糖含有半乳糖73-85％，葡萄糖5.5-8.5％，甘露糖2.5-8％，鼠李糖2-6％，岩藻糖1.5-3.8％和木糖1.2-2.5％。该发明还涉及该组合物的制备方法，以及采用该方法制得的组合物。该发明的组合物具有显著的抗氧化活性，可以应用于食品抗氧化以及果蔬保鲜。

7、由于不同微生物之间的正相互作用，人们发现应用两种或两种以上微生物混合发酵能更好地解决实践中的许多问题。在过去几年中，对微生物的混合发酵的应用以及其中微生物之间的相互作用机理的研究取得了明显进展，主要包括以下几个方面(1)生物质的降解利用(2)对环境污染物的降解(3)生产特定的代谢产物(4)混合发酵的工艺。申请人曾使用发酵液混合发酵，在专利文件cn110408671b中公开了一种混合培养裂殖壶藻和雨生红球藻产dha和虾青素的方法，在雨生红球藻生长期后的发酵液中接种裂殖壶藻进行混菌发酵培养，具有简化培养过程，降低生产成本，提高油脂提取时的稳定性等特点。

8、现有技术中对于裂殖壶菌胞外多糖的利用和分离显然并不适合追求效率、成本的饲料领域。因此，研究微生物相互作用，开发微生物混合培养的潜力，对解决发酵生产中遇到的问题是十分有意义的。

技术实现思路

1、针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种藻粉的制备方法及产品和应用，尤其提供一种dha藻粉的制备方法及产品和应用。本发明提供的制备方法利用裂殖壶菌与酵母菌的混合发酵，降低发酵液胞外多糖含量，解决喷雾干燥过程中产品黏壁和堵塞设备的问题，具有更高的底物利用率，更高的产品得率，更低的设备维护成本和产品性能更优的dha藻粉产品，符合节能绿色的生产理念，有利于生态环境的保护。

2、为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：

3、第一方面，本发明提供一种dha藻粉的制备方法，所述方法包括如下步骤：将裂殖壶菌种子液接种至发酵培养基中发酵，在发酵培养后期，接入酵母菌混合发酵，至发酵结束得含有dha的发酵液，再进行喷雾干燥，得所述dha藻粉。

4、本发明所述的制备方法是在裂殖壶菌发酵后期的发酵液中接种一定量的酵母活化液进行混菌发酵培养，所述裂殖壶菌发酵后期的发酵液中常含有大量的副产物胞外多糖，胞外多糖会造成发酵液最大溶氧量下降，粘度增大，不利于裂殖壶菌后续的生长与发酵，发酵液的黏性特性还会造成喷雾干燥过程中黏壁和设备堵塞现象的出现，进而还会影响dha藻粉产品的质量。酵母在发酵培养后期加入，酵母能够以胞外多糖为底物，酵母首先消耗发酵液中单糖，然后分泌胞外酶降解多糖，将多糖分解成单糖后吸收，而发酵后期体系中的单糖已所剩无几，因此酵母会快速利用多糖，从而降低发酵液胞外多糖的含量，有效的降低发酵液的粘度，从发酵工艺源头解决喷雾干燥过程因发酵液粘度过大而出现的黏壁和堵塞的问题，并且制得产品因含较少胞外多糖，产品得率高dha含量高，性能优异。此外该制备方法操作简单，适宜工业化放大。

5、优选地，所述酵母菌的接种量为裂殖壶菌发酵液体积的5-15％。

6、所述5-15％中的具体数值可以选择5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％或15％等，上述各项数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。

7、本发明所涉及的加入酵母菌的接种量为裂殖壶菌发酵液体积少于5％时，胞外多糖未被酵母菌消耗完全，发酵液胞外多糖问题并未良好解决；当酵母菌接种量高于15％时，过多的酵母菌会过度消耗发酵液中的营养物质，对裂殖壶菌后期代谢造成干扰，造成藻粉中重要成分dha的降低，因此当酵母菌接种量在5-15％之间时，胞外多糖能够被酵母菌充分消耗的同时，酵母菌在发酵液中的含量适中，几乎不会对裂殖壶菌的代谢造成影响，进一步地发酵液中胞外多糖含量变低，发酵液的粘度更低，且胞外多糖含量的降低提供了更利于混菌发酵环境，dha产品得率及产品中dha含量更高。

8、优选地，所述混合发酵的过程中维持混合发酵液ph不低于6，例如ph可以为6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5或10等，更优选ph在6-9之间，例如ph可以为6、6.5、7、7.5、8、8.5或9等，上述各项数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。

9、本发明所涉及的混合发酵体系中发酵液的ph不低于6时，尤其是ph在6-9之间时，混菌体系中两种菌具有更好的细胞状态，胞外多糖含量更低，发酵液粘度更低，dha藻粉产品更不易黏壁或阻塞管道，产品得率更高且产品中dha含量更高。

10、优选地，所述维持混合发酵液ph使用酸碱调节剂。

11、优选地，所述酸碱调节剂包括柠檬酸、碳酸氢钠、碳酸钠、盐酸或氢氧化钠中的任意一种或至少两种的组合，所述至少两种的组合可以是柠檬酸和碳酸氢钠的组合、碳酸氢钠和碳酸钠的组合、碳酸钠和盐酸的组合等，其他任意的组合方式均可选择，在此便不再一一赘述。

12、优选地，所述酸碱调节剂为柠檬酸和氢氧化钠。

13、本发明所涉及的裂殖壶菌发酵后期加入酵母菌进行混合发酵，其中酵母菌消耗发酵液中单糖和多糖的过程中，会造成发酵液ph下降，不利于混菌的生长，所述混合发酵过程加入酸碱调节剂后，更适宜的发酵液ph更有利于两种菌的生长代谢与裂殖壶菌的生产发酵。当酸碱调节剂特定选择柠檬酸和氢氧化钠的组合时，所述混合发酵过程发酵液ph调节更加稳定，且柠檬酸、氢氧化钠与碳酸钠及碳酸氢钠相比，调节ph的过程中不会产生二氧化碳气体，不会对发酵过程中的气体体系造成影响。

14、优选地，所述发酵培养后期为裂殖壶菌发酵结束前的20-40h。

15、所述20-40h中的具体数值可以为20h、24h、28h、32h、36h或40h等，上述各项数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。

16、优选地，发酵的培养总时间为110-130h。

17、所述110-130h中数值可以为110h、114h、118h、122h、126h、130h等，上述各项数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。

18、以上，可以理解的是，本发明所涉及的接入酵母菌的时间能够依据总发酵培养的时间得到，例如，当总发酵培养时间为120h时，则接入酵母的时间为第80-100h。酵母菌过早接种会对裂殖壶菌的生长和发酵生产造成影响，dha藻粉产品中的dha含量也会因此降低；当接种酵母菌的时间至发酵结束的时间短于20h，酵母菌发酵时间短，不能充分消耗发酵液中的胞外多糖，进一步地，会造成发酵液粘度大，及喷雾干燥过程中出现黏壁、堵塞现象，且dha藻粉得率低。因此当接入酵母菌的时间为裂殖壶菌发酵结束前的20-40h时，喷雾干燥过程中出现黏壁、堵塞的现象更少，dha藻粉的得率和产品中dha含量更高。

19、优选地，所述的酵母菌包括酿酒酵母。

20、由于酿酒酵母的多糖分解能力普遍存在的，而本发明主旨也并非酿酒酵母的代谢产物，所以在此对于酿酒酵母的型号不做限定。

21、本发明所述酵母菌包括酿酒酵母时，混合发酵过程发酵液的胞外多糖含量更低，产品dha藻粉也具有更丰富的营养价值。

22、优选地，所述喷雾干燥的进风温度为160-220℃。

23、所述160-220℃中的数值可以为160℃、170℃、180℃、190℃、200℃、210℃或220℃等，上述各项数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。

24、优选地，所述喷雾干燥的出风温度为70-100℃。

25、所述70-100℃中的数值可以为70℃、75℃、80℃、85℃、90℃、95℃或100℃等，上述各项数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。

26、本发明所涉及的喷雾干燥进风温度选择160-220℃、出风温度为70-100℃时，喷雾干燥的效率更高。

27、优选地，所述喷雾干燥前还包括所述含有dha的混合产物离心脱水步骤，使得固体物质含量在混合产物含量的20％以上。

28、所述20％以上的具体数值为20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％等，上述各项数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。

29、优选地，所述裂殖壶菌种子液的制备方法包括裂殖壶菌的活化并扩大培养。

30、优选地，所述裂殖壶菌种子液的接种量为发酵培养基体积的3-10％。

31、所述3-10％的具体数值为3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％等，上述各项数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。

32、优选地，所述裂殖壶菌的活化培养时间为30-50h。

33、所述30-50h中数值可以为30h、34h、38h、42h、46h或50h等，上述各项数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。

34、优选地，所述扩大培养的培养时间为20-40h。

35、所述20-40h中数值可以为20h、24h、28h、32h、36h或40h等，上述各项数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。

36、优选地，所述将裂殖壶菌种子液接种至发酵培养基中发酵和所述混合发酵的温度独立地为25-30℃，发酵的通气量独立地为1-2vvm。

37、所述25-30℃中的数值可以为25℃、26℃、27℃、28℃、29℃或30℃，上述各项数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。

38、所述1-2vvm中的数值可以为1vvm、1.2vvm、1.4vvm、1.6vvm、1.8vvm、或2vvm，上述各项数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。

39、优选地，所述酵母菌在接种前进行活化并扩大培养。

40、优选地，所述活化的培养时间为30-50h。

41、所述30-50h中数值可以为30h、34h、38h、42h、46h或50h等，上述各项数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。

42、优选地，所述扩大培养的培养时间为20-40h。

43、所述20-40h中数值可以为20h、24h、28h、32h、36h或40h等，上述各项数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。

44、优选地，所述将裂殖壶菌种子液接种至发酵培养基中发酵的前30h溶氧量为20-80％，30h后的溶氧量为5-80％。

45、所述20-80％的具体数值为20％、30％、40％、50％、60％、70％或80％等，上述各项数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。

46、所述5-80％的具体数值为5％、20％、35％、50％、65％、70％、75％或80％等，上述各项数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。

47、第二方面，本发明提供一种dha藻粉，所述dha藻粉根据第一方面所述的制备方法制得。

48、优选地，所述dha藻粉中含有酵母菌，所述dha藻粉中dha的含量大于20％，水分低于5％。

49、所述大于20％的具体数值可以为20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％等，上述各项数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。

50、所述低于5％的具体数值可以为1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％或4.5％等，上述各项数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。

51、本发明所涉及的dha藻粉产品含有藻粉和酵母粉，含有丰富的dha，且较单一的裂殖壶菌藻粉产品而言还含有酵母粉，酵母粉低脂、低糖、低胆固醇、富含丰富的蛋白质和维生素，会使dha藻粉具有更多元化的营养元素，且混合发酵过程还会产生一些有机酸和酮类物质，提高了最终产品的营养价值。此外，该dha藻粉糖含量低，产品各类营养元素分布更均匀，各批次产品质量更稳定。

52、第三方面，本发明提供如第一方面所述的制备方法或如第二方面所述的dha藻粉在制备动物营养剂中的应用。

53、相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：

54、本发明所述的制备方法是在裂殖壶菌发酵后期的发酵液中接种一定量的酵母活化液进行混菌发酵培养，所述裂殖壶菌发酵后期的发酵液中常含有大量的副产物胞外多糖，胞外多糖会造成发酵液最大溶氧量下降，粘度增大，不利于裂殖壶菌后续的生长与发酵，发酵液的黏性特性还会造成喷雾干燥过程中黏壁和设备堵塞现象的出现，进而还会影响dha藻粉产品的质量。酵母在发酵培养后期加入，酵母能够以胞外多糖为底物，酵母首先消耗发酵液中单糖，然后分泌胞外酶降解多糖，将多糖分解成单糖后吸收，而发酵后期使体系中的单糖已所剩无几，因此酵母会快速利用多糖，从而降低发酵液胞外多糖的含量，有效的降低发酵液的粘度，从发酵工艺源头解决喷雾干燥过程因发酵液粘度过大而出现的黏壁和堵塞的问题，并且制得产品因含较少胞外多糖，产品得率高产品颗粒均匀dha含量高，性能优异。此外该制备方法操作简单，适宜工业化放大。