一种赖氨酸脱羧酶突变株及其在戊二胺生产中的应用的制作方法

本发明属于生物工程，特别是涉及一种赖氨酸脱羧酶突变株及其在戊二胺生产中的应用。

背景技术：

1、戊二胺，又名尸胺，它与二元酸聚合可合成高分子聚酰胺材料(即尼龙)。全球每年生产约700万吨聚酰胺材料，消耗了大量石化资源。石化资源是不可再生资源，因此，生物法合成聚酞胺的重要组成单体戊二胺是未来技术的发展趋势，具有重要的经济学和生态学意义。

2、专利申请号cn201910117962.8公开了一种赖氨酸脱羧酶菌株及其在戊二胺生产中的应用，该专利是通过基因工程方法将赖氨酸脱羧酶基因导入大肠杆菌后的重组生物工程菌为原始菌株，经过ntg(亚硝基胍)诱变筛选得到的高酶活力赖氨酸脱羧酶菌株，保藏编号为：cgmcc no.16762；该菌株虽然酶活力得到了显著提升，但是温度耐受性依然较低，在实际生产温度比较高的情况下，酶活会迅速下降，导致生产时酶的需求量较大；因此，筛选酶活高、耐高温的赖氨酸脱羧酶菌种是解决生产成本、提高生产效率的迫切问题。

技术实现思路

1、本发明所要解决的第一个技术问题是：提供一种由诱变方法筛选到的酶活高、耐高温的赖氨酸脱羧酶菌株，满足市场需要。

2、本发明所要解决的第二个技术问题是：诱变得到的赖氨酸脱羧酶菌株在戊二胺生产中的应用。

3、为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：

4、一种赖氨酸脱羧酶突变株，命名为jym-cada-02，该菌种已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行菌种保藏，菌种保藏编号为cgmcc no.25793(保藏分类命名为大肠埃希氏菌，拉丁文为escherichia coli,保藏日期2022.09.28)；

5、该菌以专利申请号cn201910117962.8中的构建的工程菌株e.coli bl21(de3)-pet24a-cada为出发菌株，经artp等离子体诱变得到突变株，该突变株相较于原始菌株，氨基酸序列中第369位氨基酸由leu突变为cys；具体的诱变筛选方法为：

6、a.菌悬液的制备：

7、将-80℃甘油管中保藏的工程菌(e.coli bl21(de3)-pet24a-cada)用接种环划线接种至lb固体培养基(含卡那霉素50mg/l)，37℃培养24h，挑选平板活化的单菌落，接种至装有50ml lb培养基(含卡那霉素50mg/l)250ml摇瓶中，37℃，150rpm培养至对数生长期(od600约为10左右时)，6000rpm离心收集菌体，使用50ml 0.1mm磷酸盐缓冲溶液(pbs)洗涤两次，最后加入一定量的pbs溶液使菌体浓度约为108cfu/ml，制备得到菌悬液；

8、b.常压常温等离子体(artp)诱变：

9、使用artp-iis诱变育种仪，以高纯氦气作为工作气源，电源功率100w，照射距离2mm，气体流量10slm，等离子体射流温度为28-35℃条件下，吸取10μl菌悬液于无菌钢板载片上，设置照射处理时间20s，40s，60s，100s，处理完成后使用1ml无菌pbs缓冲液冲洗载片上的菌体至无菌离心管中，并涂布在筛选平板中生长；

10、c.突变株的筛选：

11、从步骤b生长的平板中，挑选致死率为90％左右的平板，进行突变筛选，挑选菌落周围紫色变色圈较大的单菌落，接种至摇瓶中发酵培养，摇瓶发酵培养至培养液稀释25倍后od600值达到0.2时后加入iptg(终浓度0.1mmol/l)，继续培养8h结束培养，检测筛选菌株发酵液的赖氨酸脱羧酶酶活力，通过与初始菌株酶活的对比，筛选出正突变菌株。

12、优选的，所述的步骤b中筛选平板的培养基为：酵母提取物5g/l，胰蛋白胨10g/l，氯化钠10g/l，l-赖氨酸5g/l，溴甲酚紫0.0015％，琼脂20g/l，调节ph5.5，115℃灭菌20min。

13、优选的，所述的步骤c摇瓶发酵的培养液为：lb培养基含卡那霉素50mg/l。

14、赖氨酸脱羧酶突变株在戊二胺生产中的应用，jym-cada-02在戊二胺生产中的应用，具体的生产步骤为：

15、s1.种液培养：将jym-cada-02菌株接种于种子培养基中，37℃，转速220rpm，培养12h；

16、s2.发酵培养：按1％比例接种发酵培养基中，温度37℃，转速500转/分，通气比1.5vvm，通过补料控制葡萄糖浓度0.1-0.5g/l，待培养液稀释25倍后od600值达到1.0时，加入诱导剂，控制发酵温度25-28℃，转速500转/分，通气比1.5vvm，继续培养8-10h结束培养；

17、s3.转化：发酵结束后，离心收集菌体，弃掉上清，将菌体重悬于ph6.0的磷酸盐缓冲液(pbs)中，获得粗酶液；配制含有400g/l赖氨酸盐酸盐和0.1mmol/l辅酶的溶液，添加1-5％粗酶液，构成转化体系，转化温度35-40℃，转化1h，底料赖氨酸完全转化后再次补加赖氨酸盐酸盐(浓度300g/l)，转化过程中通过加酸控制ph6.0-8.0，继续转化2h，ph不再变化时结束转化，获得产物。

18、优选的，所述的步骤s1中种子培养基的配方为添加卡那霉素的lb培养基，卡那霉素添加量为50mg/l。

19、优选的，所述的步骤s2中发酵培养基组成为：一水葡萄糖10g/l，酵母粉5g/l，玉米浆100ml/l，(nh4)2hpo4 15g/l，kh2po4 5g/l，mgso4 4g/l，甜菜碱1g/l，10ml/l微量元素，卡那霉素30mg/l，余量为水，h2so4或naoh溶液调ph至7.0；其中微量元素的配方为：mncl25.0mg/l，mnso4 3.5mg/l，h8mon2o4 1.2mg/l，h3bo32.5mg/l，cocl2 3mg/l，znso4 5mg/l，余量为水；补料的料液组分为：葡萄糖500g/l，10ml/l微量元素，余量为水。

20、优选的，所述的步骤s2中诱导剂为iptg，iptg添加至其终浓度为0.1mmol/l。

21、优选的，所述的步骤s3中辅酶为磷酸吡哆醛。

22、优选的，所述的步骤s3中ph值控制所加的酸为无机酸或有机二元酸，其中无机酸为硫酸、盐酸或硝酸中的一种；有机二元酸为脂肪族二元酸、己二酸、丁二酸、癸二酸、十一酸或十二酸中的一种。

23、进一步的，所述的有机二元酸为己二酸或丁二酸。

24、由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：

25、本发明通过等离子体诱变(artp)对专利申请号cn201910117962.8中的赖氨酸脱羧酶工程菌e.coli bl21(de3)-pet24a-cada进行诱变处理，筛选得到1株赖氨酸脱羧酶突变株(jym-cada-02)，该突变株中氨基酸序列中第369位氨基酸由leu突变为cys；该突变株与原始菌赖氨酸脱羧酶的产物戊二胺浓度及催化效率相比，戊二胺产量比原始菌提高了6.13％，其摩尔转化率比原始菌提高了4.99％；在45℃下剩余酶活85.2％，是原始菌的1.13倍。本发明提供的赖氨酸脱羧酶突变体在耐高温及催化能力方面有大幅度提高，将其应用到戊二胺生产中，有效的降低了戊二胺的生产成本，提高了生产效率，更加适合于工业生产。