一株猫冠状病毒及其应用

本发明属于生物领域，涉及一株猫冠状病毒(feline coronavirus,fcov)及其应用。

背景技术：

1、猫传染性腹膜炎(feline infectious peritonitis，fip)是一种猫的渐进性、致死性传染病，主要发于2岁以下的猫及多猫环境。除了感染家猫之外，貂、老虎、猎豹、狮子等野生猫科动物亦见fip。患病猫的一般临床症状包括嗜睡、厌食、体重减轻、发热、黄疸、腹部膨大、呼吸急促、淋巴结肿大、黏膜苍白、葡萄膜炎、共济失调、癫痫发作等。在发病猫的血液、渗出液、脑脊液、房水、组织(肝、脾、肾、肠系膜淋巴)均可检测到病毒存在。fip的病原体是猫冠状病毒(feline coronavirus,fcov)。

2、猫冠状病毒是有囊膜的、单股正链rna病毒，隶属于冠状病毒科、冠状病毒属、尼多目病毒科。病毒粒子表面有刺突状纤突，病毒基因组大小约为30kb。根据致病性不同，猫冠状病毒又被分为猫肠道冠状病毒(feline enteric coronavirus,fecv)和猫传染性腹膜炎病毒(feline infectious peritonitis virus,fipv)两种生物型，fecv感染仅引起轻微的、自限性的肠炎，fecv组织嗜性改变使其突变为fipv，进而引起致命的fip。根据病毒s蛋白的差异，猫冠状病毒又可以分为ⅰ型和ⅱ型两种血清型。ⅱ型fcov能够使用常见猫细胞系进行分离培养，是开展fcov研究的主要材料。受限于合适的细胞系和未知的病毒受体，流行率更高(>90％)的ⅰ型猫冠状病毒分离培养困难，因此缺乏自然的ⅰ型fipv动物模型。

3、对fipv的分子流行病学调查并不鲜见，但由于分离培养困难而缺乏fipv攻毒模型。在动物水平对抗猫冠状病毒药物进行评估，只能依赖于广泛收集临床病例，大大影响了动物实验准确度和精密度。wang等人通过反向遗传系统，将ii型fipv s蛋白胞外域替换到i型fipv上，拯救出一株重组fipv，建立了fip口服感染模型(wang et al2021)。但该重组病毒本质上属于ⅱ型fipv，不能完全反映占绝大多数的(>90％)ⅰ型fip病例。

4、经过资料的查询和信息的核对，目前尚无ⅰ型fipv动物模型，主要原因在于缺乏可用于攻毒并产生临床症状的毒株。因此亟需稳定、可靠、接近自然发病的ⅰ型fip动物模型，应用于fipv相关疫苗、药物的研发，这对现有技术中存在的问题的解决具有重大的科学意义与应用价值。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一株猫传染性腹膜炎病毒ⅰ型毒株，该毒株可以引起动物产生典型的fip症状和病理变化，进而可用于构建攻毒模型并用于抗fipv相关药物或疫苗的研究，旨在解决现有毒株无法构建ⅰ型fipv动物模型的问题。

2、为实现上述目的，申请人从武汉市洪山区某动物医院的fip病猫中筛选到一株猫冠状病毒，通过对该病毒的结构基因进行测序比对，发现其与目前所报道的i型fcov相似性最高，因此鉴定该病毒属于血清型ⅰ型猫传染性腹膜炎病毒。该病毒已于2022年11月10日送交中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为：cctcc no:v202297，分类命名为猫冠状病毒(feline coronavirus)fcov/wh/2022-1，保藏地址：中国武汉。

3、申请人将含有病毒的腹水腹腔注射回归至健康实验猫，发现动物产生明显fip症状和病理变化，而将另外收集的30余份fcov核酸阳性fip病例腹水回归到实验动物猫却不能引起fip而实现病毒复壮，初步证明本发明筛选的毒株在导致fip症状方面的表现不同于现有大多数毒株。接着，申请人将毒株s蛋白与此前报道的多株i型fcov进行比对，发现s蛋白序列最高相似性仅为92.70％，在第phe5、arg13、glu33、gly65、lys79、arg128、tyr234、gln237位等多处氨基酸位点发生变异，这可能是导致以上表型差异的原因之一。

4、申请人制备了5.275拷贝数/1ul的组织病毒液，将其倍比稀释后对实验猫腹腔注射攻毒，得到该毒株的半数致死剂量(ld50)为0.5275copies。攻毒后的实验猫体温上升，体重减轻，血液淋巴细胞下降，血清淀粉样蛋白水平升至明显炎症水平，剖检可见病死猫有典型fip症状，腹腔大量淡黄色粘稠积液，肝脏表面黄白色结节，脾脏表面不平整，肠系膜及肠壁有结节，免疫组化诊断到病死猫病变组织器官有fcov n蛋白阳性信号。至此，使用该病毒成功构建了ⅰ型fipv动物模型，症状和病理特征均与临床fip相同。

5、最后，申请人利用构建的动物模型进行了药物筛选试验，进一步验证了该模型的可靠性，可以用于评价抗猫冠状病毒药物。

6、本发明的有益效果是：

7、ⅰ型fcov对外界环境抵抗力差，很难在体外对其进行分离和传代培养，同时其受体结合域容易发生变异，感染力不稳定，导致ⅰ型fcov很难感染动物产生与临床fip相同的症状和病理特征。本发明针对现有技术缺乏ⅰ型fipv动物模型以及用于构建该模型的毒株，通过大量试验筛选，得到一株能引起动物产生典型fip症状和病理变化，能稳定构建ⅰ型fipv动物模型的毒株，该毒株在fipv相关疫苗、药物的研发中具有重大的科学意义与应用价值。

技术特征：

1.一株猫冠状病毒，分类命名为猫冠状病毒(feline coronavirus)fcov/wh/2022-1，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：cctcc no:v202297，该病毒为血清型ⅰ型猫传染性腹膜炎病毒(feline infectious peritonitis virus)。

2.如权利要求1所述的猫冠状病毒，其特征在于，该病毒的s基因核苷酸序列如seq idno：1所示。

3.权利要求1所述的病毒在制备猫冠状病毒药物筛选模型中的应用。

4.一种猫冠状病毒药物筛选模型的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

5.如权利要求4所述猫冠状病毒药物筛选模型的制备方法，其特征在于：所述100％最小致死剂量为5.275copies。

6.如权利要求4所述猫冠状病毒药物筛选模型的制备方法，其特征在于：所述攻毒方法是腹腔注射。

7.如权利要求4所述猫冠状病毒药物筛选模型的制备方法，其特征在于：所述实验猫为6月龄。

8.异槲皮苷在制备抗猫冠状病毒药物中的应用。

技术总结
本发明公开了一株猫冠状病毒，分类命名为猫冠状病毒(Feline Coronavirus)FCoV/WH/2022‑1，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCCNO:V202297。该病毒属于猫传染性腹膜炎病毒Ⅰ型，可以引起动物产生典型的FIP症状和病理变化，进而可用于构建攻毒模型并将其用于抗FIPV相关药物或疫苗的研究。本发明解决了现有毒株无法构建Ⅰ型FIPV动物模型的难题，为相关药物及生物制品研发提供稳定可靠的保障。

技术研发人员：彭贵青,胡小帅,沈洲,陈奕熹,焦哲
受保护的技术使用者：华中农业大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/12