基因芯片及绵羊的SNP位点组合在分析绵羊生长相关性状中的应用

基因芯片及绵羊的snp位点组合在分析绵羊生长相关性状中的应用
技术领域
1.本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及基因芯片及绵羊的snp位点组合在分析绵羊生长相关性状中的应用。


背景技术：

2.我国本土绵羊品种具有耐粗饲、适应性强、饲料转化率高等优势，但耐寒性、肉质等经济性状优势良莠不齐。尽管当前中国肉羊存栏量和羊肉产量位居世界第一，但仍不能有效满足国内市场日益高涨的羊肉消费需求。我国绵羊饲养规模、产肉量和产业化程度等不断提高，这些生产提高主要归功于技术进步而非技术效率。例如人工授精和同期发情技术大大提高了绵羊繁殖率。这些问题的主要原因之一是我国绵羊遗传育种技术仍以传统表型性状选育为主，选育周期长、准确性低。此外长期混乱引种、无序杂交不但没有稳定改良本土品种反而造成本土绵羊品种遗传资源的严重流失。因此基于我国本土绵羊品种优势，利用现代化分子遗传育种改良手段培育具有优秀经济性状的本土绵羊品种是目前我国绵羊产业亟待解决的问题。
3.snp是生物基因组单核苷酸变异引起的dna序列遗传变异，位点丰富、具有高代表性及稳定性，且检测技术成熟，在动植物种质资源鉴定、遗传进化分析、分子标记辅助育种等方面起重要作用。gbs液相芯片技术是一种基于简化基因组测序获取目标基因组部分信息以代表全基因组信息，减少测序序列，降低单位个体样本测序成本，同时又能够获得大量snp信息，更适合大群体基因分型的需要，在分子遗传改良中存在巨大优势，已大量应用于国内小麦等农作物、牛和猪等家畜遗传选育。
4.绵羊现有商业化snp芯片主要由illumina和affymetrix公司研发推出。包括illumina sheep hd genotyping beadchip(680k)、illumina ovine snp50 beadchip(50k)和affymetrix ovis600k genotyping beadchip等。其中illumina 50k芯片包括覆盖绵羊全基因组的54241个snp位点，可广泛用于全基因组关联分析、qtl定位、基因优选及比较基因组学等研究，在学术研究中被广泛应用。尽管绵羊snp芯片产品众多，但现有的绵羊snp芯片主要基于西方品种绵羊的遗传数据，缺乏中国绵羊品种与国外绵羊品种结合的snp数据，同时存在功能性位点和区域分布较为分散、位点密度过大、中国绵羊群体位点检出频率低、实际生产中推广应用成本高等诸多问题，因此设计一款适于中国绵羊品种优秀种质资源挖掘、对耐寒性、肉质以及多胎性等多个核心经济性状进行快速有效检测的snp芯片，具有十分重要的意义。
5.鉴于此，特提出本发明。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于，基于绵羊核心生长相关性状的snp位点组合，开发出分析绵羊生长相关性状的分子探针组合、基因芯片、试剂盒。利用本发明提供的snp位点信息，能够快
速准确的实现绵羊生长相关性状评价、种质资源评估、优秀种质资源挖掘、品种选育、市场肉质检测、品种鉴定及溯源，有利于我国绵羊种质遗传资源研究、保护和改良。
7.本发明是这样实现的：
8.一种绵羊的snp位点组合在分析绵羊生长相关性状中的应用，绵羊的snp位点组合包括5131个snp位点，绵羊的snp位点组合的物理位置信息基于绵羊v4.0基因组序列比对确定，绵羊的snp位点组合如下所示：
9.10.11.12.13.14.15.16.17.18.19.20.21.22.23.24.25.26.27.28.29.30.31.32.33.34.35.36.37.38.39.40.41.42.43.44.[0045][0046]
针对上述5131个snp位点在oar4.0基因组上的位置及其上下游各200bp长度采用靶向捕获测序技术设计引物并进行探针合成，从而得到绵羊5k液相芯片。相较于传统可检测到5131个固定位点突变碱基类型的液相芯片，本发明对位点上下游碱基序列设计引物探针以对目标突变位点的序列进行检测，通过构建dna高通量测序文库，捕获文库中包含目标位点的dna片段。获得的dna片段进行扩增和纯化产物经高通量测序后，测序结果与绵羊参考基因组比对，从而获取待测样本的基因组基因分型。本发明检测方法可检测到更多的snp位点信息，设计灵活，后期可随时添加感兴趣的标记位点进行迭代更新。
[0047]
上述5131个snp位点组成的组合，能够快速从基因水平上对绵羊个体的核心经济性状进行评价，以获得更准确的育种评估信息，对具有优秀核心经济性状的个体进行选育，能够缩短育种世代间隔，加速育种进程，节约育种成本。
[0048]
上述的5131个snp位点组合的获得方法如下：是基于发明人前期在绵羊群体中发掘并验证的性状相关位点、期刊等文献报道的经济性状相关snp位点、世界范围内13个绵羊品种共3966只绵羊个体进行遗传信息采集、ncbi数据库snp子库中人和小鼠snp位点等多个数据库经过去重、筛选作为绵羊全基因生长相关性状总snp集合；进一步选取该集合所有位点上下游各200bp序列与ncbi绵羊v4.0参考基因组进行比对，筛选序列位点覆盖率＞88％的位点，共计5131个位点最终作为本发明生长相关性状snp位点。
[0049]
该snp位点组合覆盖率高，代表性强。
[0050]
此外，利用本发明提供的生长相关性状snp位点组合，还能够从肉质、脂质沉积等角度实现绵羊品种的鉴定和溯源，为我国绵羊的种质资源保护和遗传改良提供技术支撑。
[0051]
本发明提供了分析绵羊生长相关性状的分子探针组合，其检测待测样品中上述的snp位点组合，snp位点组合的物理位置信息基于绵羊v4.0基因组序列比对确定。
[0052]
本领域的技术人员容易根据本发明提供的snp位点，采用现有的引物设计和分析软件在snp位点的上下游设计相应的引物和/或探针，从而便于后续的检测。
[0053]
例如在探针上设置检测标记，如在探针的5’端设置荧光报告基团，在探针的3’端设置荧光猝灭基团。如荧光报告基团为hex、fam、tet、cf532、joe、tamra、rox、cy3、cy5、texas red、ned、alexa flour或vic，淬灭基团为mgb、tamra、bhq1、bhq2、bhq3或qsy。
[0054]
探针的类型例如taqman或taqman-mgb探针。
[0055]
本发明还提供了分析绵羊生长相关性状的基因芯片，基因芯片上负载有上述的分
子探针组合。
[0056]
基因芯片包括不限于液相芯片、固相微珠芯片等。
[0057]
本发明还提供了分析绵羊生长相关性状的试剂，其包括上述的分子探针组合。
[0058]
此外，上述试剂在实际应用中还可包括稳定剂、缓冲液等。
[0059]
本发明还提供了分析绵羊生长相关性状的试剂盒，其包括上述的分子探针组合或上述的基因芯片。
[0060]
本发明还提供了一种分析绵羊生长相关性状的方法，其包括如下步骤：将待测绵羊的基因组dna的5131个snp位点基因型与对照绵羊基因组dna的5131个snp位点基因型进行比对，对照绵羊基因组dna的5131个snp位点为权利要求1的snp位点组合，snp位点组合的物理位置信息基于绵羊v4.0基因组序列比对确定。
[0061]
本发明还提供了一种分析绵羊生长相关性状的方法，应用上述的分子探针组合、基因芯片、试剂或试剂盒对待测样品进行检测。
[0062]
在本发明应用较佳的实施方式中，上述绵羊生长相关性状选自绵羊的产毛性状、生长性状、繁殖性状、肉质性状、泌乳性、多胎性、耐寒性、脂质沉积能力和产肉率中的至少一种。
[0063]
产毛性状选自：产毛量、净毛率、毛的品质、裘皮和羔羊品质中的至少一种；
[0064]
繁殖性状例如包括：窝数、初生重、窝重、产胎率等。
[0065]
上述的分子探针组合、基因芯片、试剂或试剂盒的用途，用途为如下任一种：
[0066]
(1)在绵羊生长相关性状评价中的应用；(2)在绵羊品种筛选的应用；(3)在绵羊品种鉴定中的应用；(4)在绵羊品种溯源中的应用；(5)在绵羊种质资源评价中的应用；(6)在绵羊种质资源研究中的应用；(7)在绵羊种质资源改良中的应用；(8)在绵羊种质资源保护中的应用；(9)在绵羊辅助育种中的应用；(10)在绵羊群体遗传系谱构建中的应用；(11)在绵羊基因分型中的应用。
[0067]
本发明还提供了一种分子探针组合或基因芯片在制备分析绵羊生长相关性状的试剂盒中的应用。
[0068]
本发明具有以下有益效果：
[0069]
本发明提供的5131个snp位点组成的组合，能够快速从基因水平上对绵羊个体的生长相关性状进行评价，以获得更准确的育种评估信息，对具有优秀核心经济性状的个体进行选育，能够缩短育种世代间隔，加速育种进程，节约育种成本。
[0070]
此外，利用本发明提供的生长相关性状snp位点组合，还能够从产毛性状、生长性状、繁殖性状、肉质性状、泌乳性、多胎性、耐寒性、脂质沉积能力和产肉率等角度实现绵羊品种的鉴定和溯源，实现肉质的检测，为我国绵羊的种质资源保护和遗传改良提供技术支撑。
[0071]
本发明基于上述snp位点组合，提供的绵羊核心经济性状snp位点形成的探针组合、基因芯片、试剂盒与现有的高密度芯片相比，通量小、成本低，分析简便快速，适用性广，市场前景广阔。
附图说明
[0072]
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附
图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
[0073]
图1为snp位点在绵羊染色体上的分布情况；
[0074]
图2为扩增序列比对结果。
具体实施方式
[0075]
下面将参考具体实施方式的详细描述对本发明进一步说明，但以下实施例仅是说明性的，而不能理解为对本发明的范围限制，凡基于本发明内容所实现的技术均属于本发明的范围。对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化，在不违背本发明的思想下，本领域技术人员在此基础上对本发明做出的各种改动或者修改，同样应属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所采用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所采用的生物信息软件和产品也均为可商业获得的。未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。
[0076]
需要说明的是，本发明提供的位点组合及应用均是本技术的发明人经过艰苦的创造性劳动和优化工作才得以完成。
[0077]
需要说明的是，本发明所称的生物产品包括但不限于基于本发明提供的位点组合形成的引物、探针、基因芯片、试剂盒等。
[0078]
需要说明的是，本发明所称的绵羊核心经济性状围绕耐寒性、产肉率、肉质、生长性状、脂质沉积能力、多胎性等多个角度体现，根据实际生产需要，本领域技术人员可自行设置性状阈值，从而判断绵羊经济性状的优劣。
[0079]
本发明的所称的snp是指单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism)，主要指在基因组水平上由单核苷酸的变异所引起的dna序列多态性，所述单核苷酸的变异包括由单个碱基的转换、颠换、插入或缺失所导致的变异，是动植物研究中重要的分子标记手段之一。
[0080]
需要说明的是，本发明所称的分子标记为一切可遗传并可检测的dna序列或蛋白质，包括但不限于基于分子杂交的分子标记，如rflp、cish等；基于pcr技术的分子标记，如rapd、ssr和sscp等；基于限制性酶切和pcr技术的分子标记，如aflp、caps等；基于dna芯片技术的分子标记，如snp、est等。本发明提供的分子标记可以用于全基因组关联分析、种质资源鉴定和遗传进化、基因定位研究和分子遗传育种等。
[0081]
需要说明的是，本发明所称的探针是一段带有检测标记，且顺序已知的，与目的基因互补的核酸序列(dna或rna)，例如taqman、taqman-mgb探针。
[0082]
需要说明的是，本发明所称的试剂盒为本领域常规使用的任意一种包含检测或实验所用试剂，便于操作人员能够摆脱繁重的试剂配制及优化过程的盒子，其中还包含有扩增本发明提供的位点信息的引物、检测本发明提供的位点信息的分子标记或探针或基因芯片，还包括扩增所用的酶和缓冲液等。
[0083]
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
[0084]
实施例1
[0085]
核心经济性状snp位点组合的获得。
[0086]
1)根据团队绵羊群体试验筛选验证得出的snp位点。
[0087]
结合团队前期在绵羊群体中发掘并验证的性状相关位点，同时在web of science、pubmed、elservier数据库标题检索(“snp”or“livestock”or“meat quality”or“lipid metabolism”or“cold exposure”or“energy metabolism”or“economic traits”)，在中国知网和万方数据知识服务平台标题检索“snp”或“家畜”或“肉质”或“脂质代谢”或“冷暴露”或“能量代谢”或“经济性状”，获得发表时间为2010-01-01至2021-01-01的文献。剔除重复文献，共计1030条关于羊、牛、猪的目标文献进行荟萃分析，剔除重复位点后初步获得的相关snp位点951个。
[0088]
2)从国内外多个绵羊品种测序数据筛选得到的显著snp位点。
[0089]
为了实现国内外绵羊品种和遗传信息的全面覆盖，发明人对世界范围内13个绵羊品种共3966只绵羊个体进行遗传信息采集，包括新西兰萨福克羊、新西兰美利奴羊、罗姆尼羊、考力代羊、罗姆尼羊、无角陶赛特羊、湖羊、滩羊、小尾寒羊、藏羊、阿勒泰羊、国内萨福克羊、杜蒙萨三元杂交羊。对所有绵羊样本包括但不限于血液、组织、皮肤、毛发、排泄物等提取样本遗传信息(dna等)。对例如adrb3、ucp1、cast、scd、fecb等多个核心性状相关靶基因设计引物进行基因分型并结合表型数据分析筛选获得显著相关性遗传snp位点集。此外，对绵羊群体遗传信息利用高通量测序并比对ncbi绵羊参考基因组(v4.0)，测序获得部分snp位点集。
[0090]
3)源于经济性状功能基因在ncbi数据库snp子库中人和小鼠snp位点。
[0091]
文献荟萃获得的snp位点对应基因定义为核心经济性状候选基因，在ncbi数据库snp子库中筛选所有候选基因临床研究显著性snp位点，共筛选得到人和小鼠snp位点8167个。
[0092]
由于经济性状功能基因在人和小鼠中研究更为广泛和前沿，因此在荟萃分析中选择与人和小鼠的snp功能基因显著相关位点集合并比对至绵羊oar4.0基因组。
[0093]
4)绵羊全基因总snp集合获得
[0094]
上述三种方式组合形成一个snp集合，共计9491个snp位点，作为绵羊全基因核心经济性状总snp集合。选取该集合所有位点上下游各200bp序列与ncbi绵羊v4.0参考基因组进行比对，筛选序列位点覆盖率＞88％的位点，共计5131个位点最终作为本发明生长相关性状snp位点。
[0095]
实施例2
[0096]
分析绵羊生长相关性状的引物组合及探针组合。
[0097]
本领域技术人员根据本发明提供的生长相关性状snp位点组合中的位点的序列信息选择合适的限制性内切酶进行酶切，选取酶切后的片段用t4 dna连接酶连接。根据连接产物设计引物，并将设计得到的引物利进行特异性比对、二级结构和tm值评估，最终获得特异性好、灵敏度高，并且可以在同一反应条件下高效实现检测目的位点的引物。
[0098]
其中，特异性比对、二级结构评估及tm值评估可以采用本领域常用的任意一种方式进行。
[0099]
上述方法均为常规方法，根据本发明提供的生长相关性状snp位点组合中的位点信息，不再需要付出创造性劳动的情况下就能获得，因此，根据本技术提供的生长相关性状snp位点组合获得引物也属于本发明的保护范围。
[0100]
同样的，利用本发明提供的生长相关性状snp位点组合制备的分子探针，例如taqman探针也属于本发明的保护范围。
[0101]
实施例3
[0102]
分析绵羊生长相关性状的基因芯片。
[0103]
本发明的snp基因芯片依托经过高度优化的genobaits技术平台，将实施例2获得的引物或探针固定在液相载体表面，直接合成实施例2获得的引物或探针。
[0104]
本发明的gbs方法是利用物理手段或者选用内切酶对全基因组dna进行限制性酶切，然后对带有标签序列的酶切片段富集并进行高通量测序，在高质量参考基因组或单倍型图谱的辅助下，借助于大规模累计的简化测序数据，通过全基因组snp位点信息并进行基因分型，在较小的测序量下获得覆盖全基因组的高密度分子标记方法。该技术步骤简单，dna纯化步骤少，无需进行片段大小选择，可检测大量缺失基因型，尤其在分析多态性低和重复序列高的物种上更占优势，成本相对低廉，目前已在部分植物上实现高效、大规模的基因组测序。
[0105]
需要说明的是，本领域技术人员可以采用任一一种方式制备检测绵羊生长相关性状的snp基因芯片，同样也可以委托生物公司制备，但是基于本发明提供的生长相关性状snp位点组合制备的snp基因芯片均属于本发明的保护范围。
[0106]
实施例4
[0107]
绵羊生长相关性状的分析试剂盒。
[0108]
本发明提供的生长相关性状snp检测试剂盒包括基于实施例2和实施例3snp位点组合获得的引物或探针或基因芯片。根据使用类型的不同，还包括相应的检测试剂，例如检测试剂包括：基于实施例1获得的snp位点组合设计taqman探针，荧光定量pcr反应常规使用的缓冲液、连接酶、taqman probe等。
[0109]
本领域技术人员根据使用方式的不同配置不同的绵羊生长相关性状检测snp试剂盒，但是基于本发明提供的生长相关性状snp位点组合配置的检测试剂盒均属于本发明的保护范围。
[0110]
实验例1
[0111]
发明人针对靶标基因ucp1基因进行基因型检测，基因型的组合和基因突变如下表1所示。female其中，aa指代组合位点的基因型分别为cc&gg，ab指代组合位点的基因型分别为ct&gg，bb指代组合位点的基因型分别为tt&gg，bc指代组合位点的基因型分别为tt&ga。
[0112]
表1ucp1基因型
[0113][0114]
基因分型
[0115]
对试验绵羊采集颈静脉血样并将血样保存在fta卡上带回实验室；用打孔器在fta卡血样采集区取样，取样片置于pcr管中；pcr管中加入200μl 20mm naoh溶液，60℃加热器加热约15min，直至血样褪色；真空泵吸净naoh，然后加入200μl te(tris-edta)(ph＝8)缓
冲液，常温静置8min；吸净te，只留处理后的血样圆片，pcr管开口过夜，充分干燥后保存；分别向每个dna管中加入上下游引物(各0.8μl)、10ul taq酶和7.6μl ddh2o进行pcr扩增；扩增体系为：95℃预变性2min，95℃30s(变性)-60℃30s(退火)-72℃30s(延伸)，扩增35个循环，72℃最终延伸10min后，4℃保存。扩增产物进行sanger测序后，通过mega(ver:x,usa)对扩增序列比对结果进行判型(图2)。
[0116]
将两个snp位点的组合基因型与个体的肉质性状进行相关分析。数据采用spss20.0软件(spss，chicago，usa)的混合线性模型进行统计分析，基因型和性别设置为固定效应。采用卡方检验检测数据是否符合正态分布规律，正态分布的数据采用单因素方差分析duncan检验分析数据显著性。非正态分布的数据采用非参数检验(kruskal-wallis)分析数据显著性。p value《0.05差异具有统计学意义。
[0117]
不同的基因型组合与屠宰性状的差异性分析参照表2所示。female为母羊，wether为羯羊。
[0118]
表2ucp1基因型组合间屠宰性状差异
[0119][0120]
结果表明，ucp1不同基因型组合对绵羊屠宰率有显著影响，其中bb基因型组合模式显著提高了绵羊屠宰率。
[0121]
发明人还进行不同的基因型组合与间背最长肌氨基酸的差异性分析，参照表3所示，表3最左侧为不同氨基酸的类型。
[0122]
表3ucp1基因型组合间背最长肌氨基酸差异
[0123]
[0124][0125]
结果表明，ucp1不同基因型组合对绵羊背最长肌氨基酸含量具有显著影响，bb基因型组合模式显著改善了绵羊背最长肌氨基酸含量。
[0126]
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。