用于常规PCR扩增的免提取型核酸释放剂的制作方法

用于常规pcr扩增的免提取型核酸释放剂
技术领域
1.本发明涉及pcr扩增技术领域，特别涉及用于常规pcr扩增的免提取型核酸释放剂。


背景技术：

2.pcr扩增是是一种用于放大扩增特定的dna片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊dna复制，能将微量的dna大幅增加。pcr由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成：首先将模板dna加热至93℃左右一定时间后，使模板dna双链或经pcr扩增形成的双链dna解离成为单链，以便与引物结合；然后温度降至55℃左右进行退火，引物与模板dna单链的互补序列配对结合；随后，dna模板-引物结合物在72℃、耐热dna聚合酶(例如taqdna聚合酶)的作用下，以dntp为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板dna链互补的半保留复制链；上述一个循环需2-4min，重复循环上述变性-退火-延伸过程，每循环2-3h就能将目的基因扩增放大几百万倍。随后再将经过pcr放大后的产物进行检测。
3.在进行pcr扩增之前，需要获得待扩增的目的基因或dna模板，常用方法是将生物样本细胞裂解，使目的基因或dna模板释放出来。现有关于核酸释放或者核酸提取主要采用碱裂解法、浓盐法、苯酚抽提法、水抽提法、阴离子去污剂法、硅胶膜法和磁珠法等。这些方法提取核酸耗时长，很多情况下都需要使用专业试剂盒，并按照试剂盒说明书要求一步步操作，耗时很长，对操作人员专业技术水平和仪器的要求较高。此外在核酸提取时必须在超净工作台上进行，否则容易产生污染，或者提取浓度不达标。针对这一现状，如何实现恒温、快速、简便的一步法提取核酸技术，具有可观的发展前景。


技术实现要素：

4.针对以上现有技术的不足，本发明提供了一种用于常规pcr扩增的免提取型核酸释放剂，具体通过以下技术实现。
5.一种免提取型核酸释放剂，其特征在于，其原料配方为tritonx-100 1-5wt％、dtt 10-15mm、edta 1-4.5mm、tris-hcl 10-50mm、naoh 50-150mm和水。
6.本发明提供的核酸释放剂中，naoh提供了一个碱性环境，使细胞膜更容易破裂，释放核酸。细胞在裂解的过程中，非离子型表面活性剂tritonx-100一方面可以加速细胞外膜蛋白和脂类的溶解，加快核酸释放，另一方面可以很好的对核酸特别是单链的rna起到保护作用，使rna能够在碱性环境中得以保存；金属离子螯合剂edta可以结合溶液中的金属离子，从而抑制rna酶活性，阻止核酸降解；tris-hcl为缓冲液，调节体系稳定；dtt为还原剂可以打断二硫键，使染色体dna结合的蛋白质从dna上释放出来，破坏蛋白质的稳定活性。本发明提供的核酸释放剂，只需要进行简单的混合、孵育，即可直接进行常规pcr扩增；而不需要任何提纯、离心等多余步骤，有效节省了时间。
7.优选地，本发明提供的核酸释放剂的原料配方为tritonx-100 1wt％、dtt12.5mm、
edta 2mm、tris-hcl 10mm、naoh 100mm和水。
8.优选地，本发明提供的核酸释放剂的原料配方还含有0.001wt％的提取指示剂，所述提取指示剂为溴酚蓝、石绿、甲基红、甲基橙、罗丹明、溴甲酚绿、品红、二甲酚橙、二苯胺或刚果红中的一种。
9.本发明提供了一种细胞样品的核酸提取试剂盒，含有上述任一项所述的免提取型核酸释放剂。
10.本发明还提供了一种细胞样品的核酸提取方法，其步骤为：在细胞样本(位于离心管中)中加入上述免提取型核酸释放剂，涡旋振荡均匀；然后室温孵育，孵育期间定期(颠倒)混匀一次；孵育结束后，可以直接进行后续pcr扩增。
11.优选地，上述核酸提取方法中，加入的所述细胞样本的体积为1-200μl，且所述样本和免提取型核酸释放剂的体积比为(0.5-2):1。
12.优选地，上述核酸提取方法中，涡旋振荡的转速为1000-3000rpm，时间为15-30s。
13.优选地，上述核酸提取方法中，室温孵育的时间为10-15min，孵育期间每隔3-5min颠倒混匀一次。
14.与现有技术相比，本发明的有益之处在于：本发明提供的核酸释放剂，在于样品混合、孵育后，即可直接放入pcr扩增仪中进行pcr处理。相比于目前常见的核酸释放剂而言，省略了提纯、离心等步骤，经过直接pcr扩增后的目的核酸产物电泳条带单一、清晰。
附图说明
15.图1为实施例1-3制备的核酸释放剂在裂解后的电泳图；
16.图2为对比例1-4制备的核酸释放剂在裂解后和多比例稀释的裂解混合液的电泳图。
具体实施方式
17.下面将对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动条件下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
18.以下实施例和对比例所提供的免提取型核酸释放剂，其所有原料试剂来源为：1139-100ml tritonx-100和1340-500g edta采购于biofroxx，m10913701naoh采购于国药集团，d806827-5gdtt和t917654-100ml tris-hcl采购于麦克林公司，p111-01 2
×
taq master mix采购于vazyme。
19.实施例1
20.本实施例提供的免提取型核酸释放剂，其原料和最终浓度为tritonx-1001wt％、dtt 12.5mm、edta 2mm、tris-hcl 10mm、naoh 100mm和超纯水，ph值为7.33。
21.实施例2
22.本实施例提供的免提取型核酸释放剂，其原料为tritonx-100 1.5wt％、dtt15mm、edta 1mm、tris-hcl 50mm、naoh 150mm和超纯水，ph值为7.50。
23.实施例3
24.本实施例提供的免提取型核酸释放剂，其原料为tritonx-100 5wt％、dtt10mm、
edta 4mm、tris-hcl 10mm、naoh 50mm和超纯水，ph值为7.33。
25.对比例1
26.本对比例提供的免提取型核酸释放剂，其原料为tritonx-100 1wt％、dtt12.5mm、edta 2mm、tris-hcl 10mm、naoh 200mm和超纯水。即相对于实施例1的核酸释放剂，仅仅将naoh的浓度调整为200mm，ph值为7.88。
27.对比例2
28.本对比例提供的免提取型核酸释放剂，其原料为tritonx-100 1wt％、dtt12.5mm、edta 2mm、tris-hcl 10mm、naoh 100mm、吐温-80 1wt％和超纯水。即在实施例1的核酸释放剂配方的基础上，还加入了一定量的吐温-80，ph值为7.33。
29.对比例3
30.本对比例提供的免提取型核酸释放剂，其原料为tritonx-100 1wt％、dtt12.5mm、edta 2mm、tris-hcl 10mm、naoh 100mm、nacl 300mm和超纯水。即在实施例1的核酸释放剂配方的基础上，还加入了一定量的nacl，ph值为7.33。
31.对比例4
32.本对比例提供的免提取型核酸释放剂，其原料为tritonx-100 1wt％、dtt12.5mm、edta 2mm、tris-hcl 10mm、naoh 100mm、n-月桂酰肌氨酸钠0.05wt％和超纯水。即在实施例1的核酸释放剂配方的基础上，还加入了一定量的n-月桂酰肌氨酸钠，ph值为7.33。
33.应用例：实施例和对比例的核酸释放剂效果验证
34.通过使用上述实施例和对比例提供的免提取型核酸释放剂，对不同来源的细胞进行裂解，并直接进行常规pcr扩增，具体的裂解和常规pcr扩增方法如下。
35.1、样本提取
36.本发明分别处理采集了1份来源于不同人的唾液、hpv16细胞、鼻拭子样本，加入保存液保存，待用；hpv16细胞来源于南京高科医院，鼻拭子和人的唾液样本采集于实验室人员样本，保存液采购于上海白益生物科技有限公司，将细胞样本和唾液样本吸取10ul，加入到200ul的保存液中，取到的鼻拭子样本将棉签头部直接浸泡在200ul的保存液中，一起放入4℃冰箱保存。
37.2、样本细胞裂解
38.按照以上各实施例和对比例的配方和方法，将核酸释放剂的各原料，涡旋振荡，制成核酸释放剂；再将核酸释放剂与唾液(编号为：ty94102307)、hpv16细胞(编号8694)、鼻拭子(编号b073422)这三种样本均分别按照体积比1:1混合均匀，进行裂解10-15min，得到裂解混合液。
39.裂解液快速提取基因组dna的方法：
40.(1)取200μl样本放入1.5ml离心管中；
41.(2)向步骤(1)的离心管中加入200μl核酸释放剂，3000rpm涡旋振荡均匀；
42.(3)再将裂解混合体系放置于室温孵育15min，期间每隔5min颠倒混匀一次，得到裂解混合液，待用。
43.3、常规pcr扩增
44.(1)试剂和仪器
[0045]2×
taq master mix试剂采购于vazyme公司，扩增引物对选用的是种属为人的内
参基因gapdh，采购自上海生工生物有限公司；
[0046]
常规pcr扩增相关的实验仪器：pcr仪和凝胶成像系统采购于杭州柏恒生物公司，电泳槽采购于北京六一生物公司；
[0047]
(2)实验过程
[0048]
取上一步制备的裂解混合液2.5μl，直接作为常规pcr扩增模板，按照下述常规pcr体系进行扩增；
[0049][0050]
常规pcr扩增反应程序为：先95℃反应5min；然后95℃反应30s，55℃反应30s，72℃反应30s，循环32次；再72℃反应1min；最后于4℃保存。
[0051]
4、凝胶电泳实验
[0052]
(1)试剂：10
×
loading buffer，dl2000 dna marker采购于takara；
[0053]
(2)方法与结果：采用1％琼脂糖凝胶进行电泳试验，以不加入裂解混合液(用灭菌水代替)的扩增体系作为阴性对照，以gapdh质粒扩增体系作为阳性对照。
[0054]
如图1所示，采用实施例1-3制备的核酸释放剂分别对唾液、hpv16细胞、鼻拭子这三个样本进行裂解，采用对比例1-4制备的核酸释放剂对唾液样本进行裂解。每个附图中从左至右分别对应的是299bp的条带，第21、22条带对应阳性对照和阴性对照。可以看到，采用实施例1-3的核酸释放剂(如图1中的编号1-9的条带)，只有实施例1(如图1编号1-3的条带)所对应的电泳条带明亮且边缘清晰，可以稳定的达到良好的裂解效果，对于后续pcr扩增试验不会有影响；而采用对比例1-4的核酸释放剂(如图2中编号11、9、7和5的条带)，编号12、10、8、6为阳性对照组对应的条带，明显影响了现有体系的稳定，所对应的电泳条带不明亮，或有的直接没有实现扩增。
[0055]
随后，将采用实施例1的核酸释放剂裂解唾液样本之后的裂解混合液用灭菌水分别稀释2倍、5倍和10倍，进行pcr扩增。最终电泳结果如图2(编号1-4对应的条带)所示。图中，从左至右分别为裂解混合液不稀释、稀释2倍、5倍和10倍的条带，可以发现，将混合液稀释之后，电泳条带逐渐变暗，说明不对混合液进行稀释，裂解效果更好。
[0056]
综上试验结果可以看到，只有采用本发明提供的配方制备的核酸释放剂，才可以将裂解混合液直接放入pcr扩增仪中进行扩增。一旦改变了核酸释放剂中的配方，如果直接扩增就不能得到清晰明亮的条带，即pcr结果受到影响。
[0057]
以上具体实施方式详细描述了本发明的实施，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节。在本发明的权利要求书和技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单改型和改变，这些简单变型均属于本发明的保护范围。