一种样本保存液、试剂及保存样本的方法与流程

1.本发明涉及生物工程技术领域，具体而言，涉及一种样本保存液、试剂及保存样本的方法。


背景技术：

2.传统的病原微生物检测方法主要包括形态学检测、微生物培养、涂片镜检、抗原抗体检测和核酸检测，这些方法也仍然在临床上广泛应用，然而这些临床实验室检测方法由于其自身方法学的原因存在不同的局限性。随着分子生物学技术的发展，病原分子诊断被逐渐应用于临床。
3.病原宏基因组测序(metagenomics next generation sequencing，mngs)是一种不依赖于培养、也无需预设病原，直接从患者感染病灶部位标本中提取核酸，实现病原体种属鉴定的高通量测序技术。与传统临床的实验室检测方法相比，病原mngs是基于核酸水平对病原微生物的核酸序列进行检测，它可以突破不同病原体类型的局限性，无偏向性的全面覆盖数千甚至上万种的病原体，同时鉴定细菌、真菌、病毒、结核和寄生虫等多种类型病原微生物。
4.由于待检样本含有一定的病原微生物，在采集后由于一些客观条件，需要进行保存和运输，存在一定的传染和降解风险，因此开发一种有利于保存且能有效灭活病原微生物的保存液势在必行。
5.鉴于此，特提出本发明。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于提供一种样本保存液、试剂及保存样本的方法以便于保存和运输待检样本，本发明提供的样本保存液能降低待检样本的传染和降解风险，能有效灭活病原微生物。
7.本发明是这样实现的：
8.第一方面，本发明提供了一种样本保存液，其包括：稳定剂、灭活剂、缓冲剂和水，稳定剂选自甜菜碱，灭活剂选自氯己定和阳离子表面活性剂中的一种或者至少两种的混合物。
9.甜菜碱是一种两性表面活性剂，具有良好的灭菌效果，且与灭活剂配合，可以协同提升灭菌效果。而且甜菜碱和灭活剂在较低的浓度下就能有效地杀灭微生物细胞，故优选它们。此外，为进行微生物细胞的灭活处理，氯己定和阳离子表面活性剂可以单独使用或，如果需要的话，将其中两个或多个组合在一起混合使用。
10.缓冲剂用于调节样本保存液的ph。
11.在本发明应用较佳的实施方式中，上述样本保存液中甜菜碱的浓度为1-10％(w/v)；浓度太低时，就无法达到预期的灭活微生物细胞的有效效果。另一方面，如果其浓度太高就会引起例如处理后的废液处理、工业用酶的失活等问题，因此考虑到所使用的微生物
细胞的稳定性，发明人对甜菜碱的最适浓度进行了筛选，发现在上述浓度范围下既可以有效灭活微生物细胞，还可以维持-20℃～4℃下的样本的稳定性，尤其是-20℃和4℃下的样本稳定性。
12.例如样本保存液中甜菜碱的浓度为1％，2％，3％，4％，5％，6％，7％，8％，9％或10％。
13.在一种可选的实施方式中，样本保存液中甜菜碱的浓度为5-10％(w/v)。在上述浓度下，在-20℃，4℃下样本保存液具有良好的保存效果，样本的稳定性良好，且灭活效果良好。
14.在本发明应用较佳的实施方式中，上述样本保存液中灭活剂的浓度为0.01-0.1％(w/v)。
15.在使用离子表面活性剂的时候，在灭活处理时添加高浓度的该溶液可能会引起微生物细胞的细菌裂解、破裂和聚集。添加低浓度的该表面活性剂是有效的。
16.在一种可选的实施方式中，样本保存液中灭活剂的浓度为0.05-0.1％(w/v)。略微增大样本保存液中灭活剂的浓度有助于提升样本保存液的灭活效果。
17.在本发明应用较佳的实施方式中，上述阳离子表面活性剂为季铵化合物。
18.在一种可选的实施方式中，季铵化合物包括不限于：苯扎氯铵、苯扎溴铵、苯索氯铵、西吡氯铵、十二烷基二甲基苯氧乙基溴化铵和十六烷基三甲基溴化铵中的至少一种。
19.在本发明应用较佳的实施方式中，上述缓冲剂选自磷酸盐缓冲液；
20.在一种可选的实施方式中，磷酸盐缓冲液选自磷酸氢二钠溶液、磷酸二氢钠溶液、磷酸氢二钾溶液或磷酸二氢钾溶液。
21.在本发明应用较佳的实施方式中，上述样本保存液的ph为6.5-8.0。发明人证实，样本保存液的ph对于样本液的稳定性影响不大，但对于灭活效果影响较为明显。在上述ph条件下具有良好的灭活效果。
22.在一种可选的实施方式中，样本保存液的ph为7.0-8.0时，具有更优的灭活效果。
23.在一种可选的实施方式中，样本保存液的ph为7.5-7.8时，具有更优的灭活效果。
24.在一种可选的实施方式中，样本保存液的水为灭菌注射用水。
25.在一种可选的实施方式中，样本为血液、血清、血浆或尿液。
26.在本发明应用较佳的实施方式中，上述样本保存液包括：浓度为1～10％的甜菜碱，浓度为0.01～0.05％的氯己定，其余为灭菌注射用水，用缓冲剂调节样本保存液的ph为7.5。在该条件下，样本保存液的灭活效果良好，添加样本保存液后的样本液的稳定性较好。
27.在一种可选的实施方式中，样本保存液包括：浓度为1～10％的甜菜碱，浓度为0.01～0.1％的季铵化合物，其余为灭菌注射用水，用缓冲剂调节样本保存液的ph为7.5。在该条件下，样本保存液的灭活效果良好，添加样本保存液后的样本液的稳定性较好。
28.在一种可选的实施方式中，样本保存液包括：浓度为1～10％的甜菜碱，浓度为0.01～0.05％的氯己定，浓度为0.01～0.05％的季铵化合物，其余为灭菌注射用水，用缓冲剂调节样本保存液的ph为7.5。
29.第二方面，本发明还提供了一种试剂或试剂盒，试剂或试剂盒含有上述的样本保存液。本发明提供的样本保存液可以用于检测试剂或试剂盒。
30.第三方面，本发明还提供了一种样本液，其包括样本和上述的样本保存液。
31.第四方面，本发明还提供了一种保存样本的方法，其包括如下步骤：将待保存的样本与上述的样本保存液混合。
32.在一种可选的实施方式中，在-20℃～4℃下进行样本的保存。如-20℃～-4℃下保存。
33.本发明具有以下有益效果：
34.本发明提供的样本保存液能降低待检样本的传染和降解风险，能有效灭活病原微生物。甜菜碱是一种两性表面活性剂，具有良好的灭菌效果，且与灭活剂配合，可以协同提升灭菌效果。而且甜菜碱和灭活剂在较低的浓度下就能有效地杀灭微生物细胞。此外，为进行微生物细胞的灭活处理，氯己定和阳离子表面活性剂可以单独使用或将其中两个或多个组合在一起混合使用。
具体实施方式
35.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
36.以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
37.实施例1
38.本实施例提供了一种样本保存液，制备方法包括以下步骤：取甜菜碱1g和氯己定0.01g至100ml量瓶中，加入适量水使溶解，加入水至刻度，混匀后，用磷酸氢二钠溶液调节ph值到7.5。
39.实施例2
40.本实施例提供了一种样本保存液，制备方法包括以下步骤：取甜菜碱1g和氯己定0.01g至100ml量瓶中，加入适量灭菌注射用水使溶解，加入灭菌注射用水至刻度，混匀后，用磷酸氢二钠溶液调节ph值到7.5。
41.实施例3
42.本实施例提供了一种样本保存液，制备方法包括以下步骤：取甜菜碱10g和氯己定0.01g至100ml量瓶中，加入适量灭菌注射用水使溶解，加入灭菌注射用水至刻度，混匀后，用磷酸氢二钠溶液调节ph值到7.5。
43.实施例4
44.本实施例提供了一种样本保存液，制备方法包括以下步骤：取甜菜碱10g和氯己定0.05g至100ml量瓶中，加入适量灭菌注射用水使溶解，加入灭菌注射用水至刻度，混匀后，用磷酸氢二钠溶液调节ph值到7.5。
45.实施例5
46.本实施例提供了一种样本保存液，制备方法包括以下步骤：取甜菜碱10g和氯己定0.05g至100ml量瓶中，加入适量灭菌注射用水使溶解，加入灭菌注射用水至刻度，混匀后，用磷酸盐缓冲液调节ph值到7.0。
47.实施例6
48.本实施例提供了一种样本保存液，制备方法包括以下步骤：取甜菜碱10g和氯己定
0.05g至100ml量瓶中，加入适量灭菌注射用水使溶解，加入灭菌注射用水至刻度，混匀后，用磷酸盐缓冲液调节ph值到6.5。
49.实施例7
50.本实施例提供了一种样本保存液，制备方法包括以下步骤：取甜菜碱10g和氯己定0.05g至100ml量瓶中，加入适量灭菌注射用水使溶解，加入灭菌注射用水至刻度，混匀后，用磷酸盐缓冲液调节ph值到8.0。
51.实施例8
52.本实施例提供了一种样本保存液，制备方法包括以下步骤：取甜菜碱10g和苯扎氯铵0.5g至100ml量瓶中，加入适量灭菌注射用水使溶解，加入灭菌注射用水至刻度，混匀后，用磷酸氢二钠溶液调节ph值到7.5。
53.实施例9
54.本实施例提供了一种样本保存液，制备方法包括以下步骤：取甜菜碱10g和苯扎溴铵0.5g至100ml量瓶中，加入适量灭菌注射用水使溶解，加入灭菌注射用水至刻度，混匀后，用磷酸氢二钠溶液调节ph值到7.5。
55.实施例10
56.本实施例提供了一种样本保存液，制备方法包括以下步骤：取甜菜碱10g和十二烷基二甲基苯氧乙基溴化铵0.05g至100ml量瓶中，加入适量灭菌注射用水使溶解，加入灭菌注射用水至刻度，混匀后，用磷酸氢二钠溶液调节ph值到7.5。
57.实施例11
58.本实施例提供了一种样本保存液，制备方法包括以下步骤：取甜菜碱10g，氯己定0.05g和十二烷基二甲基苯氧乙基溴化铵0.05g至100ml量瓶中，加入适量灭菌注射用水使溶解，加入灭菌注射用水至刻度，混匀后，用磷酸氢二钠溶液调节ph值到7.5。
59.对比例1
60.与实施例1相比，本对比实施例提供的样本保存液不含灭活剂，样本保存液的制备方法包括以下步骤：取甜菜碱1g至100ml量瓶中，加入适量水使溶解后至刻度，混匀后，用磷酸氢二钠溶液调节ph值到7.5。
61.对比例2
62.与实施例1相比，本对比实施例提供的样本保存液不含甜菜碱，样本保存液的制备方法包括以下步骤：取氯己定0.01g至100ml量瓶中，加入适量水使溶解，加入水至刻度，混匀后，用磷酸氢二钠溶液调节ph值到7.5。
63.对比例3
64.与实施例1相比，本对比实施例提供的样本保存液为含磷酸盐缓冲液ph值为7.5的灭菌注射用水。
65.实验例1
66.稳定性考察
67.选择同一份血液，平均分成16份，每份5ml，分解加入实施例1～11以及对比例1-3的保存液1ml，2份不加入任何保存液，其中1份为空白对照，为无菌水，另一份为初始对照，初始对照为血液样本在保存前进行od值检测，获得od260/od280的数值。将所有样本放置于-20℃、4℃下进行保存，分别在5天、10天和20天取样检测od值。检测od260/od280。
68.平均值的统计结果参照表1和表2所示，结果表明：对比实施例1和2可知，更换保存液中水的类型，对于样本在-20℃以及4℃下的稳定性影响不大；对比实施例1和3可知，增大甜菜碱的浓度有助于提升样本在4℃下的稳定性，尤其是在保存20天后的稳定性表现更优，而在-20℃下的样本稳定性影响不大。
69.对比实施例3和4可知，增大同一类型的灭活剂的浓度对于样本-20℃以及4℃下的保存稳定性影响不大。对比实施例4，5，6和7可知，样本保存液的ph对于样本在-20℃以及4℃下的稳定性影响不大。
70.对比实施例4，8,9,10和11可知，样本保存液的灭活剂替换为本发明中的其他灭活剂对于样本在-20℃以及4℃下的稳定性影响不大。
71.此外，单独的不加甜菜碱以及不加灭活剂均会导致样本在-20℃以及4℃下的稳定性较差，尤其是不加甜菜碱的对比例2，稳定性极差。
72.紫外结果如下
73.表1
ꢀ‑
20℃保存液od260/od280
[0074][0075]
表2 4℃保存液od260/od280
[0076][0077]
实验例2
[0078]
本实验例进行灭活效果考察。
[0079]
采用纸片法，将滤纸裁剪成直径为1cm的圆片，120℃灭菌，灭菌后分别浸泡于实施例1～11和对比例3的保存液中，同时设置无菌水作为空白对照组，备用，将实验菌(金葡菌，大肠杆菌)分别用5ml营养肉汤琼脂洗脱制成菌混液，将菌液平均涂抹于营养琼脂平板上，倒置37℃培养箱10min，使用无菌镊子取浸泡后的圆片贴在平板中间，37℃培养箱培养24h后取出观察抑菌圈直径。
[0080]
抑菌圈结果参照表3所示。
[0081]
表3抑菌圈结果
[0082]
使用的保存液金葡菌抑菌圈直径(mm)大肠杆菌菌圈直径(mm)对比例16.06.1实施例110.710.0对比例28.69.2实施例28.48.9实施例38.18.8实施例411.212.1实施例57.87.5实施例67.26.9实施例713.414.1实施例813.113.7实施例914.313.9实施例1014.815.1实施例1118.519.7对比例35.96.2空白对照5.65.8
[0083]
表3结果表明，对比实施例1和2可知，更换保存液中水的类型，对于样本保存液的灭活效果影响不大。对比实施例1和3可知，增大甜菜碱的浓度对于样本保存液的灭活效果影响不大。
[0084]
对比实施例3和4可知，增大同一类型的灭活剂的浓度对于样本保存液的灭活效果影响较大，浓度越高，灭活效果越好。对比实施例4,5,6和7可知，样本保存液的ph在7.5和8.0时灭活效果更优。
[0085]
对比实施例4，8，9，10和11可知，样本保存液的灭活剂替换为本发明中的其他灭活剂，样本保存液的灭活效果有一定影响，尤其是添加两种灭活剂可以显著提升灭活效果。
[0086]
此外，单独的不加灭活剂会导致样本保存液的灭活效果显著下降，尤其是不加甜菜碱和灭活剂的对比例3，灭活效果极差。
[0087]
综上，本发明提供的样本保存液能降低待检样本的传染和降解风险，能有效灭活病原微生物。甜菜碱是一种两性表面活性剂，具有良好的灭菌效果，且与灭活剂配合，可以协同提升灭菌效果。而且甜菜碱和灭活剂在较低的浓度下就能有效地杀灭微生物细胞。此外，为进行微生物细胞的灭活处理，氯己定和阳离子表面活性剂可以单独使用或将其中两个或多个组合在一起混合使用。
[0088]
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。