一种赤潮生物标准样品及其制备方法与流程

1.本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种赤潮生物标准样品及其制备方法。


背景技术：

2.赤潮作为一种全球性的海洋灾害，不仅严重威胁多个沿海国家的海水养殖业，而且还对人们的健康甚至生命带来影响。多数赤潮种类具有毒性，这带来了更深层次的影响。因此，及时准确地鉴定赤潮生物种类，确定是否具备毒性，是采取有效应对措施的先决条件。
3.形态分类法是最传统和直接的赤潮分类鉴定方法，也是目前赤潮监测和预警业务化分析方法。这种分类鉴定方法主要以形态学特征为基础，由监测人员借助光学显微镜对赤潮生物进行鉴别。因此，监测人员的技术能力水平直接影响了赤潮鉴定结果的准确性，进而影响了赤潮监测、预警乃至后续的治理，如何客观地评价检测人员的技术水平是目前整个海洋行业面临的问题。
4.但是目前赤潮生物监测人员技术水平差别较大，同时缺乏赤潮生物鉴定较有效的质控手段，这严重制约了管理部门和监测机构对监测能力和监测数据的评价。
5.标准样品是具有准确量值的测量标准，它在化学测量、生物测量、工程测量与物理测量领域得到了广泛的应用。赤潮生物标准样品作为赤潮种类和数量已知的物质，可以用来研究和评价赤潮鉴定方法和监测人员鉴定能力，从而判断该方法或人员能力的准确度和重复性。但目前在海洋行业普遍缺乏包括赤潮生物在内的海洋生物鉴定类的标准样品及其制备方法。
6.因此，建立一个科学合理的赤潮生物标准样品的制备方法，并据此生产赤潮生物标准样品，将有助于管理部门和监测机构对赤潮监测能力和监测数据的评价，进而促进赤潮鉴定能力的进一步提升，从而更好地应对赤潮危害。


技术实现要素：

7.本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种赤潮生物标准样品及其制备方法。本发明依据现行的标准样品制备原则，提出了一种赤潮生物标准样品的制备方法，为量化评价赤潮生物检测人员的鉴定能力水平创造条件。
8.为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
9.本发明提供了一种赤潮生物标准样品的制备方法，包括以下步骤：
10.s1、采集赤潮生物候选标准样品，通过定性分析方法，按照评判原则对候选标准样品中的候选物藻种的组成、结构、特性进行评判，确定是否满足标准样品的制备要求；
11.s2、将步骤s1最终获得的赤潮生物候选标准样品过滤；
12.s3、对筛选后的赤潮生物候选标准样品倒入分样器，得多份样品；
13.s4、随机抽步骤s3中的多份样品进行均匀性检验、稳定性检验和定值。
14.人工培养的赤潮藻株与野生藻株(检测人员分析所接触的实际样品)在形态学上
具有明显差别，培养藻株不适合作为候选标准样品，因此需要采集自然样品(即野生藻株)作为本发明的赤潮生物候选标准样品。
15.但将野生藻株作为赤潮生物候选标准样品则面临三个较突出的问题，一是野外采集的样品中存在不同种类的野生藻株，如何确定野生藻株的种类，二是如何确定这些种类的数量，并给出测量不确定度，三是野外采集的样品中不同种类的数量级差别大，必然存在一些数量极少的种类，不管如何分装，必然影响这些种类在最小包装单元的标准物质样品的数量。
16.野外采集的候选样品不仅包含赤潮生物，还包含其他类型的生物和杂质，是一个综合样品，并且除赤潮生物外的这些生物和杂质对标准样品制备、分析和保存会产生影响。
17.本发明的发明人经过大量研究及试验发现，提供一种赤潮生物标准样品的制备方法，包括赤潮生物候选标准样品的采集、定性分析、去除杂质、混合、分装、均匀性检验、稳定性检验和定值，明确了候选标准样品的选择原则、均匀性、稳定性评价方法和定值方法，解决了样品分装过程的均匀性问题，避免对样品中种类结构的破坏，最大限度地确保样品的原始状态和均匀性。
18.本发明采用孔径约500μm的过滤器过滤步骤s1最终获得的赤潮生物候选标准样品可以在不损坏野生藻种结构的基础上去除大型浮游生物和其他杂质。
19.本发明还关注标准样品保存过程中藻种形态和细胞结构的变化，避免了标准样品在使用过程中产生其他衍生问题。
20.作为本发明所述赤潮生物标准样品的制备方法的优选实施方式，所述评判原则为候选标准样品的主要种类是否有形态分类上争议、藻种的组成是否合理、分装是否会破坏藻种结构及是否保存要求。
21.优选地，定性分析方法为种类定性分析方法，更优选地，按照《海洋监测规范第7部分：近海污染生态调查与生物监测》(gb 17378.7-2007)浮游植物样品的处理与分析的要求，进行种类定性分析。
22.作为本发明所述赤潮生物标准样品的制备方法的优选实施方式，按照《赤潮监测技术规程》(hy/t 069-2005)采集赤潮生物候选标准样品。
23.作为本发明所述赤潮生物标准样品的制备方法的优选实施方式，所述过滤器为柔性过滤器，柔性过滤器优选为筛绢。
24.作为本发明所述赤潮生物标准样品的制备方法的优选实施方式，所述方法还包括一种混合原则，对于特别用途或目的的赤潮生物标准样品的制备，选取多个单种类赤潮生物候选标准样品进行混合，但要考虑混合对种类结构、密度产生的影响，同属种类容易产生混淆的种类不混合。在一些实施例中，混合是为了一些特殊目的，实现多种目标藻种在一个标准样品中存在。
25.作为本发明所述赤潮生物标准样品的制备方法的优选实施方式，所述分样器包括圆柱形的分样器壳体和管状分离器，所述分样器壳体的内部可活动的套接有所述分离器，所述分样器壳体的内部设置有与所述分离器的内径相契合的圆台，所述圆台四周的分样器壳体上环向等间距的设置有12个分样口，能够实现1分2、1分3、1分4、1分6、1分12的分样形式，分样器壳体的底座装有磁力搅拌装置、水平仪和水平调节装置。
26.所述分样器为zl 202122013100.6公开的浮游生物分样器。
27.传统的采用移液枪来分装样品的方式会严重影响样品的均匀性，采用本发明的分样器对筛选后的赤潮生物候选标准样品进行分装，既保证了赤潮藻类结构，又保证样品的均匀性，解决了样品分装过程的均匀性问题。
28.作为本发明所述赤潮生物标准样品的制备方法的优选实施方式，随机抽步骤s3中的多份样品进行分析，将获得的细胞数量进行对数转换后，采用单因子方差分析法或ss≤0.3σ准则进行均匀性检验。
29.本发明通过对显著优势种类细胞数量或样品总细胞数量进行均匀性检验，降低了标准样品制备难度，但又不影响样品的制备效果。
30.作为本发明所述赤潮生物标准样品的制备方法的优选实施方式，随机抽步骤s3中的多份样品进行分析，将获得的细胞数量进行对数转换后，采用t检验法或准则法进行稳定性检验。
31.稳定性检验可以通过检验藻种形态、结构及数量来检验赤潮生物标准样品的稳定性，同时重点检验藻种形态和细胞结构的变化，如主要鉴定特征已发生改变，则不能通过稳定性评价。
32.作为本发明所述赤潮生物标准样品的制备方法的优选实施方式，步骤s4中定值为：将多份样品中的细胞数量进行对数转换后，按照对数正态分布评定不确定度，确认赤潮生物标准样品的数值范围。
33.本发明给出了赤潮生物标准样品定值的实现路径，解决了野外采集样品的种类和数量确定问题。
34.本发明还提供了上述制备方法制备的赤潮生物标准样品。
35.本发明的方法制备的赤潮生物标准样品可用于管理部门对检测机构以及检测机构内部的能力评价，有助于评估各检测机构的赤潮鉴定能力水平，有助于评估赤潮监测数据结果的质量，为自然资源管理部门加强对监测数据的质量管控提供技术支持，也丰富了自然资源调查监测质量管理技术规程体系。
36.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
37.本发明提供了一种赤潮生物标准样品的制备方法，技术路线合理，流程完备，可以较为准确的确定藻株的种类、数量，明确了候选标准样品的选择原则、均匀性、稳定性评价方法和定值方法，有助于评估各监测机构的赤潮鉴定能力水平，有助于评估赤潮监测数据结果的质量，通过本发明制备的赤潮生物标准样品已在国家级现场比测和能力验证等活动得到应用，适于推广使用。
附图说明
38.图1为珠江口的采样站位示意图；
39.图2为大亚湾的采样站位示意图；
40.图3为分样器的爆炸结构示意图；
41.图4为分样器的平面结构示意图；
42.图5为分样器如的俯视结构示意图；
43.图6为珠江口至大亚湾的采样站位示意图；
44.附图标记：1-分离器，2-分样器壳体，3-分样口，4-磁力搅拌装置，5-水平调节装
置，6-水平仪。
具体实施方式
45.为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。
46.在以下实施例中，所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
47.一种赤潮生物标准样品的制备方法，包括以下步骤：
48.s1、采集赤潮生物候选标准样品，通过定性分析方法，按照评判原则对候选标准样品中的候选物藻种的组成、结构、特性进行评判，确定是否满足标准样品的制备要求；
49.s2、将步骤s1最终获得的赤潮生物候选标准样品经过孔径约500μm的过滤器过滤；
50.s3、对筛选后的赤潮生物候选标准样品倒入分样器，得多份样品；
51.s4、随机抽步骤s3中的多份样品进行均匀性检验、稳定性检验和定值。
52.所述评判原则为候选标准样品的主要种类是否有形态分类上争议、藻种的组成是否合理、分装是否会破坏藻种结构及是否保存要求。
53.本发明按照《赤潮监测技术规程》(hy/t 069-2005)采集赤潮生物候选标准样品。
54.在一些实施例中，所述方法还包括一种混合原则，对于特别用途或目的的赤潮生物标准样品的制备，选取多个赤潮生物候选标准样品进行混合，但要考虑混合对种类结构、密度产生的影响，同属种类容易产生混淆的种类不混合。
55.在一些实施例中，随机抽步骤s3中的多份样品进行分析，将获得的细胞数量进行对数转换后，采用单因子方差分析法或ss≤0.3σ准则进行均匀性检验。
56.在一些实施例中，随机抽步骤s3中的多份样品进行分析，将获得的细胞数量进行对数转换后，采用t检验法或准则法进行稳定性检验。
57.定值为：将多份样品中的细胞数量进行对数转换后，按照对数正态分布评定不确定度，确认赤潮生物标准样品的数值范围。
58.实施例1
59.1)赤潮生物候选标准样品采集和保存
60.2020年8月，在珠江口和大亚湾各随机布设5个站位，按照《赤潮监测技术规程》(hy/t 069-2005)的采样和保存方法要求(如表1所示)，每站采集2份样品(其中珠江口、大亚湾的采样站位示意图如图1-图2所示)，共20份(20瓶)样品，每份样品加入5％的甲醛溶液固定，用1l的聚乙烯瓶装，在4℃～10℃避光冷藏。
61.表1赤潮生物候选标准样品采样站位表
[0062][0063]
2)赤潮生物候选标准样品的制备
[0064]
①
将采集的20瓶样品随机选取10瓶样品。
[0065]
②
按《海洋监测规范第7部分：近海污染生态调查与生物监测》(gb17378.7-2007)浮游植物样品的处理与分析的要求，进行种类定性分析，并从中选取了一瓶主要优势种类(第一优势种为中肋骨条藻)形态分类无争议、优势度较适宜的样品作为赤潮生物候选标准样品。
[0066]
③
采用孔径约为500微米的筛绢过滤除大型浮游生物和其他杂质。
[0067]
④
提出一种混合原则，对于包含多种赤潮生物标准样品的制备，也可选取多个适宜的单种类赤潮生物标准样品进行混合，但要考虑混合对种类结构、密度产生的影响(混合原则:同属种类容易产生混淆的种类不混合)。2020年9月，南海环境监测中心组织技术人员从珠江口和大亚湾海域的样品中各随机选取5瓶样品，按照上述步骤筛选、浓缩(为控制分样时的体积，需要进行适当的浓缩)、混合、分装后，形成4瓶比测母样。
[0068]
⑤
将混合后的赤潮生物候选标准样品缓慢地上下颠倒数次后，倒入分样器(可1个母样分多个子样进行样品分装)内，用玻璃棒适当搅拌均匀后，快速抽出分样器分离器，赤潮生物候选标准样品即刻同时从分样器主体底部的分样孔流出，得到多份样品。
[0069]
其中，分样器(所述分样器为zl 202122013100.6公开的浮游生物分样器。)如图3至图5所示，包括圆柱形的分样器壳体2和管状的分离器1，分样器壳体2的内部可活动的套接有分离器1，分样器壳体2的内部设置有与分离器1的内径相契合的圆台，圆台四周的分样器壳体上环向等间距的设置有12个分样口3，能够实现1分2、1分3、1分4、1分6、1分12的分样形式，分样器壳体的底座装有磁力搅拌装置4、水平仪6和水平调节装置5。
[0070]
分样器壳体2上设有液位刻度标线，本实施例中分样器壳体2与分离器1均为透明材质制成。可通过桶壁液位刻度标线得到液位值，使用时可将磁力搅拌子置入分离器内，底部磁力搅拌装置通电后可调节磁力大小控制搅拌子搅拌速度，底座制有可检测水平的平衡仪6和水平调节装置5。使用时技术人员先将分离器装入主体内，然后将母样从分离器口中倒入桶内，通过水平调节装置将分样器调节水平，确保桶内母羊液体保持水平状态下进行分样操作，通过磁力搅拌装置对分离器内腔母样进行充分混合，在搅拌均匀后，或在搅拌同时可向上抽出分离器，分离器内母样液体即刻同时从分样器主体底部的分样孔流出，由于每个分样口设置有控制阀门，因此还可通过控制阀门调整分样形式，实现均匀地分到不同容积的空间中，得到多份样品，技术人员可对其中任意一份进行样品分析，得出结果。
[0071]
⑥
将多份样品由6家相关机构进行测定，第一优势种测定结果见表2。
[0072]
表2各相关机构的测试结果(个/l)
[0073][0074][0075]
将各机构测定的细胞数量进行常用对数转换后，按对数正态分布评定不确定度，获得赤潮生物标准样品的种类及数值范围：skeletonema costatum(中肋骨条藻)：(1.3～1.7)
×
104个/l。
[0076]
实施例2
[0077]
1)赤潮生物候选标准样品采集和保存
[0078]
2022年5月，在珠江口至大亚湾附近海域布设8个站位，按照《赤潮监测技术规程》(hy/t 069-2005)的采样和保存方法要求(如表3所示)，每站采集3份样品(其中采样站位示意图如图6所示)，共24份(24瓶)样品，每份样品加入5％的甲醛溶液固定，用1l的聚乙烯瓶装，在4℃～10℃避光冷藏。
[0079]
表3赤潮生物候选标准样品采样站位表
[0080][0081]
2)赤潮生物候选标准样品的制备
[0082]
①
按《海洋监测规范第7部分：近海污染生态调查与生物监测》(gb17378.7-2007)浮游植物样品的处理与分析的要求，进行种类定性分析，并从中选取了主要优势种类(第一优势种为哈德半盘藻)形态分类无争议、优势度较适宜的、同一站位的3瓶样品作为赤潮生物候选标准样品。
[0083]
②
采用孔径约为500微米的筛绢过滤除大型浮游生物和其他杂质。
[0084]
③
将赤潮生物候选标准样品缓慢地上下颠倒数次后，倒入分样器(可1个母样分多个子样进行样品分装)内，用玻璃棒适当搅拌均匀后，快速抽出分样器分离器，赤潮生物候
选标准样品即刻同时从分样器主体底部的分样孔流出，得到多份样品。将所得的样品按上述再进行一次分装，获得多份的样品。
[0085]
其中，分样器如实施例1的分样器相同。
[0086]
④
将上述多份样品中随机抽取不少于一定数量的样品进行分析，获得的细胞数量进行常用对数转换后，再采用单因子方差分析法进行均匀性检验的评价。评价结果如表4和表5所述。
[0087]
单因子方差分析法(one way anova)：
[0088]
抽取i个样品(i＝1、2、......m)，每个样在重复条件下测试j次(j＝1、2、......n)。
[0089]
每个样品的测试平均值：
[0090][0091]
全部样品测试的总平均值：
[0092][0093]
测试总次数：
[0094][0095]
样品间平方和：
[0096][0097]
样品间均方：
[0098]
ms1＝ss1/f1[0099]
样品内平方和
[0100][0101]
样品内均方：
[0102]
ms2＝ss2/f2[0103]
自由度：
[0104]
f1＝m-1
[0105]
f2＝n-m
[0106]
统计量：
[0107]
f＝ms1/ms2[0108]
若f＜自由度为(f1，f2)及给定显著性水平α(通常α＝0.05)的临界值f
α
(f1，f2)，则表明样品内和样品间无显著性差异，样品是均匀的。
[0109]
表4赤潮生物标准样品中第一优势种测试结果
[0110][0111]
表5方差分析结果
[0112][0113]
f临界值f
0.05(9,10)
＝3.02。计算的f值为0.628，该值＜f临界值，这表明在0.05显著性水平时，样品中的第一优势种是均匀的。
[0114]
⑤
将多份样品由5家相关机构进行种类鉴定，第一优势种鉴定结果见表6。采用均匀性评价的测试结果确定细胞数量。
[0115]
表6各相关机构的第一优势种鉴定结果
[0116]
机构第一优势种1hemidiscus hardmannianus(哈氏半盘藻)2hemidiscus hardmannianus(哈氏半盘藻)3hemidiscus hardmannianus(哈氏半盘藻)4hemidiscus hardmannianus(哈氏半盘藻)5hemidiscus hardmannianus(哈氏半盘藻)
[0117]
将均匀性评价的测试结果的细胞数量进行常用对数转换后，按对数正态分布评定不确定度，获得赤潮生物标准样品的种类及数值范围：hemidiscus hardmannianus(哈氏半盘藻)：(2.0～2.3)
×
103个/l。
[0118]
本发明为海洋赤潮生物标准样品的制备方法，通过这个方法制备的标准样品可用于管理部门对检测机构以及检测机构内部的能力评价，有助于评估各监测机构的赤潮鉴定能力水平，有助于评估赤潮监测数据结果的质量，为自然资源管理部门加强对监测数据的质量管控提供技术支持，也丰富了自然资源调查监测质量管理技术规程体系。
[0119]
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。