IL-8抗体及其应用

il-8抗体及其应用
技术领域
1.本发明属于单克隆抗体筛选、制备及应用技术领域，具体涉及一种抗il-8单克隆抗体及其应用。


背景技术：

2.白介素-8(il-8)又称cxcl8，属于cxc亚型，是最早发现的趋化性细胞因子。il-8分为α和β两个亚群，il-8初始翻译产物为99个氨基酸，在单核和巨噬细胞中剪切成72个氨基酸，分子量为8kda活性物质。il-8主要由单核细胞和巨噬细胞分泌，功能是募集和活化中性粒细胞，促使炎症反应和细胞杀伤。另外肿瘤细胞、成纤维细胞、内皮细胞等在il-1β、肿瘤坏死因子α、脂多糖等促炎症因子的作用下，通过自分泌或旁分泌影响肿瘤细胞的增殖、侵袭、转移以及肿瘤血管的形成。
3.il-8通过与il-8受体结合发挥作用，il-8有2种受体，分别是cxcr1(il-8ra)和cxcr2(il-8rb)，这2个受体存在77％的同源性，都属于g蛋白偶联受体。因为n端存在结构差异，2个受体与il-8的亲和性不同，cxcr1与il-8亲和性较高。在正常组织细胞中，cxcr1首先与粒细胞趋化蛋白2(gcp-2)结合形成复合体，然后与il-8结合发挥作用；cxcr2与il-8的亲和性较低，除il-8外，cxcr2还可以与cxcl1、2、3、5、7等多种配体结合。il-8对中性粒细胞有明显趋化和功能活化作用，还可诱导cd4+和cd8+t细胞的趋化，参与多种疾病的发展和组织损伤，如风湿性关节炎、牛皮藓、缺血回灌综合征(包括心肌梗死和多器官功能衰竭)、肾小球肾炎以及其他各类感染性疾病等；il-8与受体结合可通过激活pi3k/akt、plc/pkc以及mapk等多个下游信号通路促进肿瘤的发生发展。因此筛选il-8拮抗性单克隆抗体，可有效治疗il-8介导的疾病。
4.以il-8为免疫原，免疫兔子，构建抗il-8噬菌体抗体库，可有效的筛选到拮抗il-8的抗体，通过基因工程和蛋白表达技术，可大规模生产拮抗il-8抗体，用于il-8异常相关疾病的诊断和治疗。


技术实现要素：

5.本发明的主要目的是提供针对il-8的特异单克隆抗体及其应用。从免疫后的兔获取脾脏，构建抗il-8噬菌体抗体库，快速筛选针对il-8抗体，该抗体可用于il-8表达异常导致的疾病诊断和治疗。
6.本发明筛选到的il-8抗体包括：yx20
7.yx20重链cdr序列：
8.cdrh1氨基酸序列gfslnnya，见seq no.1；
9.cdrh2氨基酸序列vgsddip，见seq no.2
10.cdrh3氨基酸序列asgyvgddryni，见seq no.3；
11.yx20轻链cdr序列：
12.cdrl1氨基酸序列psvynnny，见seq no.4；
13.cdrl2氨基酸序列aas，见seq no.5；
14.cdrl3氨基酸序列agaysndsddg，见seq no.6。
15.yx20重链可变区氨基酸序列：
16.gstgdqeqlvesggrlvtpgtpltltctvsgfslnnyamswvrqapgkgleyigvvgsddipfya swakgrfaisktsttvdlkitspttedtatyfcasgyvgddryniwgpgtlvtiss，见seq no.7；
17.yx20轻链可变区氨基酸序列：
18.gstgdaavvltqtpspvsaavggtvsiscqsspsvynnnylswyqqkpgqppklliyaastlasg vpsrfkgsgsgtqftltisdvqcddaatyycagaysndsddgfgggtkleik，见seq no.8。
19.所述抗体分子包括但不限于：免疫球蛋白、fab、(fab
′
)2或单链抗体。
20.所述的il-8抗体用于制备诊断il-8表达异常疾病的制剂。
21.所述的il-8抗体用于制备治疗il-8表达异常相关的疾病。
22.il-8表达异常相关的疾病包括肿瘤。
23.本发明原核表达il-8，将获得的il-8按照1mg/只的剂量皮下注射兔子进行免疫，共进行4轮免疫，每轮间隔2周，免疫结束后，处死兔子，摘取脾脏，将脾脏研磨成单细胞悬液，分离获得单核细胞，获取单核细胞并提取总rna,合成cdna，使用重链可变区和轻链可变区兼并引物，扩增重链可变区和轻链可变区，获得的重链可变区和轻链可变区进行随机组合，并与噬菌体载体进行重组，重组产物转化xl1-blue，加入辅助噬菌体vcsm13获得滴度≈10
13
大小噬菌体抗体库。使用抗原il-8，筛选出抗il-8的抗体，通过测序，获得能与il-8结合的重链可变区和轻链可变区序列，重链可变区组装上人igg1的fc片段，抗体重链和轻链同时在哺乳动物细胞中表达，表达出人源化改造的抗il-8的抗体。通过体外实验，本发明筛选到的抗il-8单克隆抗体可以与il-8特异性结合，可用于检测或治疗il-8表达异常引发的疾病。
附图说明：
24.图1il-8基因克隆；
25.图2纯化后il-8sds-page电泳检测；
26.图3抗il8抗体重链可变区基因克隆；
27.图4抗il8抗体轻链可变区基因克隆；
28.图5抗il8抗体重链和轻链可变区基因拼接；
29.图6抗il8噬菌体阳性克隆鉴定；
30.图7elisa鉴定第5轮筛选噬菌体库；
31.图8抗体重链和轻链与pcdna3.4连接pcr鉴定；
32.图9抗体yx20纯化产物sds-page电泳检测；
33.图10抗il8抗体对中性粒细胞趋化性抑制；
34.图11抗il8抗体对体内hct116生长抑制。
具体实施方式：
35.以下结合具体实施例对本发明作进一步的描述，而不会形成对本发明的限制。
36.本发明实施例中使用的il-8蛋白实验室自行制备。
37.本发明噬菌体抗体库构建方法参考于：antony s.dimitrov(ed.),generation and selection of rabbit antibody libraries by phage display，2009，therapeμtic antibodies:methods and protocols,vol.525，101-128.
38.实施例1
39.一、il-8蛋白制备
40.以人单核细胞cdna为模板，使用引物il-8f和il-8r克隆il-8片段，并将该片段导入pgex-4t-1载体(淼灵，p0001)，筛选获得构建成功的pgex-4t-1-il-8，在iptg诱导条件下表达，纯化获得il-8蛋白。
41.具体包括以下步骤：
42.1、克隆il-8片段
43.将单核细胞cdna稀释10倍
44.(1)体系配制如下表1：
45.表1
46.cdna2μlil-8f4μlil-8r4μlddh2o40μlprimerstar(购自takara)50μltotal100μl
47.注：克隆il8基因引物
48.il8-f：gttccgcgtggatccccggaagaaggtgcagttttgccaag，见seq no.9，
49.il8-r：tcgagtcgacccgggaatttcatgaattctcagccctcttca，见seq no.10；
50.(2)反应条件见下表
51.表2
52.step198℃15sstep298℃10sstep355℃5sstep472℃5s
ꢀꢀ
go to step 2x34step572℃1m 30sstep64℃forever
53.(3)电泳
54.取25μl进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，确定是否扩增到目的条带，大小约240bp(见图1)。
55.(4)将240bp大小条带切下，使用qiaquick gel extraction kit(qiagen，28706)进行回收，测定浓度。
56.2、il-8片段与载体pgex-4t-1连接转化
57.使用北京金沙生物科技有限公司uniclone one step seamless cloning kit,货号sc612
58.(1)连接
59.体系配置
60.表3
61.组分目的重组2x uniclone seamless cloning mix5ul线性化pgex-4t-11ulil-8片段3ulddh2o1ul
62.反应条件
63.50℃，15min
64.(2)转化
65.取步骤(1)产物2.5ul加入到50uldh5α，冰上放置30min，42℃热击90s，冰上放置2min，加入1mllb培养基，37℃，220rpm培养1h，取100ul均匀的涂抹在含氨苄抗性的平板上，37℃恒温箱过夜培养。
66.(3)阳性克隆鉴定
67.挑选步骤(2)单克隆，使用引物il-8f/il-8r进行菌落pcr鉴定，鉴定为阳性的克隆，送测序公司进一步测序鉴定，序列正确的克隆保留。
68.3、il-8表达与纯化
69.(1)挑取单克隆加入到10ml含氨苄抗性lb液体培养基中，37℃，220rpm过夜培养，
70.(2)在100ml含氨苄抗性空白lb液体培养基中，接种1％步骤(1)菌液，37℃，220rpm过夜培养，od600达到0.6时，加入0.2mmol/l的iptg诱导4h。
71.(3)诱导结束后，将菌液倒入50ml离心管，4000rpm离心15min，弃上清，加入10ml平衡液(140mm nacl，2.7mmkcl，10mm na2hpo4，1.8mm kh2po4，ph7.4)重悬菌体。超声破碎，至菌液澄清。
72.(4)将破碎后的菌液转移到离心管，15000g，4℃离心20min，取上清过0.45um滤器，滤液冰上放置。
73.(5)将glutathlone beads 4ff重力柱(常州天地人和生物科技有限公司，货号sa010005)用10倍平衡液平衡，加入步骤(4)上清，让样品穿过柱子，重复4次。
74.(6)加入15倍平衡液洗柱子。
75.(7)加入5倍体积的洗脱液洗脱蛋白(140mm nacl，2.7mmkcl，10mm na2hpo4，1.8mm kh2po4，10mm还原性谷胱甘肽，ph7.4)。
76.(8)获得的目的蛋白用10kd超滤管进行浓缩，并使用10mmpbs置换缓冲液。
77.(9)浓缩后的il-8测定蛋白浓度和sds-page检测(见图2)
78.二、il-8免疫兔子
79.(1)首次免疫500ulil-8(1mg)与500ul弗氏完全佐剂混匀，2月龄新西兰大白兔，背部皮下多点注射。
80.(2)每间隔2周，500ulil-8(1mg)与500ul弗氏不完全佐剂混匀
81.新西兰大白兔背部皮下多点注射，间隔免疫3次。
82.三、噬菌体抗体库的构建
83.新西兰大白兔免疫结束后，处死，摘取脾脏，分离单核细胞，提取总rna，反转录成cdna，使用重链可变区和轻链可变区兼并引物，扩增获得重链可变区和轻链可变区片段，将抗体重链可变区和轻链可变区进行随机拼接并与噬菌体载体连接，并转化xl1-blue菌(购自于唯地生物科技有限公司)，在辅助噬菌体vscm13(购自ntcc国家典型培养物保藏中心)存在条件下，组装成噬菌体抗体展示库。
84.具体包括以下步骤：
85.1、单核细胞分离
86.使用人外周血淋巴分离液(lts1077-1，天津灏洋生物制品科技有限责任公司，)分离单核细胞。
87.(1)制备细胞悬液：将脾脏放置在细胞筛，放入加有培养基的培养皿中，使用2.5ml针头注射器推杆，轻轻的挤压，直到脾脏完全挤碎，细胞悬液转入15ml离心管中。
88.(2)将装有细胞悬液的15ml离心管，100g，10min。
89.(3)将上层细胞悬液，转入含等体积淋巴分离液的15ml离心管，用吸管小心吸取细胞悬液加于分离液之液面上，500-1100g(1800rpm)，离心10min，加速度5，减速度4。
90.(4)离心后，此时离心管中由上至下分为四层；第二层为环状乳白色淋巴细胞层。
91.(5)用吸管小心吸取第二层环状乳白色淋巴细胞层转移到新的15ml离心管中，向所得离心管中加入10mlpbs，混匀细胞。
92.(6)1800rpm，离心10min，加速度5，减速度4。
93.(7)弃上清，每支15ml离心管加入5ml的红细胞裂解液，稍微混匀后室温静置5min。
94.(8)1800rpm，离心10min，加速度5，减速度4。
95.(9)弃上清，吸取10ml pbs重悬所得细胞。
96.(10)1800rpm，离心10min，加速度5，减速度4。
97.(11)弃上清，沉淀为单核细胞。
98.2、总rna提取
99.将获得的单核细胞，按照5x106个细胞加入0.75ml trizol(thermo fisher)提取总rna，然后各取1μg rna将18份rna等量混合。
100.(1)5x106个细胞中加入0.75ml trizol。
101.(2)上下混匀数次，冰上孵育5min，保证细胞充分裂解。
102.(3)4℃12000rpm离心10分钟，将上清转移到干净离心管。
103.(4)1mltrizol中加入0.2ml氯仿，混匀。
104.(5)冰上孵育2-3min。
105.(6)4℃12000rpm离心15分钟。
106.(7)转移上清水相到干净离心管。
107.(8)上清中加入等体积的异丙醇混匀。
108.(9)室温孵育10min，4℃12000rpm离心10-15分钟。
109.(10)弃上清，保留沉淀。
110.(11)加入1ml 75％乙醇洗涤沉淀。
111.(12)4℃12000rpm离心5分钟。
112.(13)尽可能弃去上清。
113.(15)室温干燥5-10min，管壁上看不到液体。
114.(16)加入20-50μl无rnase的水回溶rna。
115.(17)取1μlrna电泳检测及测定rna浓度。
116.(18)将rna分装保存于-80℃冰箱，避免反复冻融。
117.3、cdna的合成
118.取5μg的rna，使用cdna合成试剂盒(k1612，thermo fisher)。
119.(1)取5μg rna量合成cdna。
120.(2)10μl的rna/primer mixtμre体系见下表4，包括：
121.表4
122.体系成份体积rna5μg50μm oligo(dt)
20
1μlhex random primer1μl10mm dntp1μldepc-treated water总体积10μl
123.(3)65℃孵育5min，置于冰上放置1min。
124.(4)按下表5添加其他试剂，准备cdna synthesis mix进行下一步反应。
125.表5
126.体系成分1反应10xrt buffer2μl25mm mgcl24μl0.1m dtt2μlrnaseoμt(40μ/μl)1μlsuperscript iii rt(200μ/μl)1μl
127.(5)加入10μl的cdna synthesis mix到rna/primer mixture轻轻混匀，离心，按下表6条件进行反应：
128.表6
129.step150℃50minstep285℃5min
ꢀꢀ
冰上冷却，简短离心step3rnaseh1μlstep437℃20min
130.(6)cdna产物分装保存于-20℃。
131.4、抗体重链可变区(vh)和轻链可变区(vl)扩增
132.将合成的cdna稀释10倍，用于扩增重链可变区和轻链可变区的模板。
133.(1)体系配制如下表7，以vh为例：
134.表7
[0135][0136]
(2)反应条件见下表
[0137]
表8
[0138]
step198℃15sstep298℃10sstep355℃5sstep472℃5s
ꢀꢀ
go to step 2x34step572℃1m 30sstep64℃forever
[0139]
(3)电泳
[0140]
取10μl进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，确定是否扩增到目的条带，大小约400bp(见图3)。
[0141]
(4)将所有扩增的vh等量混合，加入0.1倍体积的3m乙酸钠和2.2倍体积的乙醇，混匀，-20℃放置过夜。
[0142]
(5)4℃，16000g离心15min，去上清，使用1ml 70％乙醇漂洗(室温)，室温干燥，加入200μl水回溶，1％的胶进行凝胶电泳。
[0143]
(6)将400bp大小条带切下，使用qiaquick gel extraction kit(qiagen，28706)进行回收，测定浓度。
[0144]
(7)vl的扩增及回收按照步骤(1)-(6)进行操作，结果见图4。
[0145]
(8)调整vh和vl纯化后核酸浓度，终浓度为100ng/μl，放-20℃储存。
[0146]
5、扩增cκ-pelb
[0147]
(1)以载体pcκ和pcl(载体购自于add gene)(100ng/μl)为模版扩增cκ-pelb和cl-pelb
[0148]
以扩增cκ-pelb为例，见表9。
[0149]
表9
[0150]
pcκ10μlhck(序列见前述的参考文献)60μl
pelb(序列见前述的参考文献)60μlddh2o370μlprimerstar500μltotal1000μl
[0151]
(2)反应条件见表10
[0152]
表10
[0153][0154][0155]
(3)取10μl产物电泳检测，条带大小约400bp。
[0156]
(4)将所有扩增的cκ-pelb混合，加入0.1倍体积的3m乙酸钠和2.2倍体积的乙醇，混匀，-20℃放置过夜。
[0157]
(5)4℃，16000g离心15min，去上清，使用1ml 70％乙醇漂洗(室温)，室温干燥，加入200μl水回溶，使用1％的胶进行凝胶电泳。
[0158]
(6)将400bp大小条带切下，使用qiaquick gel extraction kit(qiagen，28706)进行回收，测定浓度。
[0159]
(7)稀释纯化后的cκ-pelb，终浓度为100ng/μl，放-20℃储存。
[0160]
(8)扩增cl-pelb，按照步骤(1)-(7)进行操作，扩增模板pcκ换成pcl。
[0161]
6、rab vκ/rab cκ/cl/rab vh融合
[0162]
(1)按下表11将不同量的vl、vh、ck-pelb混合
[0163]
vl浓度100ng/μl，vh浓度100ng/μl，cκ-pelb浓度100ng/μl
[0164]
表11
[0165]
vl10μlvh10μlck-pelb10μlprimerstar mix500μlh2o470μltotal1000μl
[0166]
(2)反应条件见表12
[0167]
表12
[0168][0169][0170]
(3)扩增rab vl/rab cκ/rab vh，见表13
[0171]
表13
[0172]
拼接产物50μlc-5'sfivl(序列见前述的参考文献)4μlc-3'sfivh(序列见前述的参考文献)4μlddh2o17μlprimerstar25μltotal100μl
[0173]
(4)扩增条件见表14
[0174]
表14
[0175]
step198℃15sstep298℃10sstep355℃5sstep472℃5s(go to step2 x 39)step572℃1m 30sstep64℃forever
[0176]
(5)电泳检测
[0177]
取10μlpcr产物，电泳检测，融合后目的基因条带大小1.2kb。(见图5)
[0178]
(6)将所有扩增的rab vl/rab cκ/rab vh，加入0.1倍体积的3m乙酸钠和2.2倍体积的乙醇，混匀，-20℃放置过夜。
[0179]
(7)4℃，16000g离心15min，去上清，使用1ml 70％乙醇漂洗(室温)，室温干燥，加入200μl水回溶，使用1％的胶进行凝胶电泳。
[0180]
(8)将1.2kb大小条带切下，使用qiaquick gel extraction kit(qiagen，28706)进行回收，测定浓度。
[0181]
(9)稀释rab vl/rab cκ/rab vh纯化的核酸，终浓度为150ng/μl，放-20℃储存。
[0182]
(10)rab vλ/rab cl/rab vh的融合按照步骤(1)-(9)进行操作。
[0183]
7、sfii酶切rab vκ/rab cκ/cl/rab vh和rabvλ/rabcl/rab vh
[0184]
以rab vκ/rab cκ/cl/rab vh酶切为例
[0185]
(1)酶切体系见表15
[0186]
表15
[0187]
human vκ/human cκ/cl/human vh(150ng/μl)200μl10xbuffer30μlh2o60μlsfii 40u/μl10μl
[0188]
(2)50℃水浴，酶切反应3h。
[0189]
(3)使用1％凝胶进行电泳，将1.2kb大小的条带切下，使用qiaquick gel extraction kit(qiagen，28706)进行回收。
[0190]
(4)检测sfii酶切后回收rab vl/rab ck/rab vh片段，调整浓度50ng/μl，-20℃保存。
[0191]
(5)酶切rab vλ/rab cl/rab vh，按照步骤(1)-(4)进行操作。
[0192]
8、sfii酶切pc3c(载体购自于add gene)
[0193]
(1)酶切体系见表16
[0194]
表16
[0195]
pc3c 1μg/μl50μl10xbuffer30μlh2o208μlsfii 40u/μl12μl
[0196]
(2)50℃水浴，酶切反应3h。
[0197]
(3)使用1％凝胶进行电泳，会切出两条带，一条3.5kb和一条1.2kb大小片段。
[0198]
(4)使用qiaquick gel extraction kit(qiagen，28706)回收3.5kb的载体骨架。
[0199]
(5)sfi酶切后回收载体骨架浓度调整为100ng/μl。
[0200]
9、连接pc3c(sfii)和rab vl/human cκ/rab vh(sfii)
[0201]
(1)连接体系见表17
[0202]
表17
[0203]
100ng/μl sfii酶切后pc3c1.5μl50ng/μl sfii酶切后human vl/human cκ/human vh2μl10xt4 dna ligase buffer2μlh2o13.5μlt4 dna ligase 2000u/μl1μl
[0204]
对照组见表18
[0205]
表18
[0206]
100ng/μl sfii酶切后pc3c1.5μl10xt4 dna ligase buffer2μlh2o15.5μlt4 dna ligase 2000u/μl1μl
[0207]
(2)16℃反应过夜。
[0208]
(3)合并所有连接反应物，加入1/10体积的3m乙酸钠溶液。
[0209]
(4)加入2.2倍体积预冷的无水乙醇，上下混合均匀，-20℃沉淀过夜。
[0210]
(5)16000g，4℃离心30min，小心弃上清。
[0211]
(6)加入70％乙醇轻轻清洗沉淀，16000g，4℃离心5min，弃上清。
[0212]
(7)室温干燥。
[0213]
(8)用适量的水进行溶解，通常1个连接反应用1μl体积ddh2o进行充分溶解,置-20℃保存。
[0214]
(9)连接pc3c(sfii)和rab vλ/rab cl/rab vh按照步骤(1)-(8)进行操作。
[0215]
10、连接产物转化xl1-blue
[0216]
(1)xl1-blue电击感受态冰上放置10min进行溶解。
[0217]
(2)取19μl沉淀浓缩后的连接产物加入到1.5ml离心管，冰浴，加入300μl的xl1-blue电击感受态混匀，快速的转入2mm电击杯，冰上放置1min。
[0218]
(3)电击条件：2.5kv，4ms
[0219]
(4)电转结束后快速加入5ml(1ml+2ml+2ml)soc培养基，转入50ml尖底离心管，37℃，250rpm，培养1h。取2μl菌液加入198μl的lb中，同时均匀的涂在含100μg/μl羧苄青霉素lb平板上，37℃放置过夜培养，用于计算转化效率及菌落pcr鉴定阳性率。pcr结果见图6。
[0220]
(5)加入10ml sb培养基，3μl 100μg/μl羧苄青霉素，和30μl 5μg/μl四环素。37℃，250rpm，培养1h。
[0221]
(6)加入4.5μl 100μg/μl羧苄青霉素，继续37℃，250rpm，培1-4h。
[0222]
(7)将培养后的菌转移到500ml培养瓶，加入84ml sb培养基，42.5μl 100μg/μl羧苄青霉素，170μl 5μg/μl四环素，加1ml vcms13辅助噬菌体(10
11-10
12
pfu/ml)，37℃，275rpm，90min。
[0223]
(8)加入140μl 50μg/μl卡那霉素，37℃，275rpm，过夜培养。
[0224]
(9)3000g，4℃离心15min。
[0225]
(10)沉淀噬菌体
[0226]
上清(200ml)转移到500ml干净离心管，加入8g peg-8000和6g nacl，放入37℃，300rpm，5min促进溶解。冰上放置30min-1h。15000g，4℃离心15min。弃上清，将离心瓶颠倒放置在滤纸上放置10min干燥，小心的移去多余液体。使用含1％的bsa的tbs 2ml重悬噬菌体(移液器上下混匀)，16000g，4℃离心5min，上清过0.22μm滤膜(millipore)，转移到2ml离心管。短时间可直接放冰上存储，或者加0.01倍体积的2％叠氮化钠放4℃，对于长时间存储加1倍体积甘油放-20℃存储。
[0227]
二、噬菌体抗体库筛选以il-8噬菌体抗体筛选为例
[0228]
使用包被il-8蛋白的96孔板，进行5轮筛选，然后挑选单克隆鉴定il-8特异性抗体。
[0229]
1、抗原包被
[0230]
(1)将il-8加入到碳酸缓冲液，浓度2μg/ml，
[0231]
(2)康宁高蛋白吸附酶联免疫96孔板，每孔加入50μlil-8，4℃放置过夜；
[0232]
(3)弃去上清，加入5％的脱脂奶粉200μl/孔，37℃放置1h；
[0233]
(4)弃上清，0.05％的tbst洗涤5次。
[0234]
2、il-8抗体筛选
[0235]
(1)将噬菌体抗体库用2％的脱脂奶粉稀释10倍，取2个包被有il-8抗原的96孔微孔，加入100μl稀释后的噬菌体，37℃放置1h。
[0236]
(2)弃上清，0.05％的tbst洗涤5次，加入100μl 100mm甘氨酸，37℃放置15min,期间不断进行吹打，加入9μl 1m tris。
[0237]
(3)将步骤(2)洗脱下来的噬菌体加入到2ml的xl1-blue菌中，室温放置15min。
[0238]
(4)加入6ml sb培养基，加入1.6μl 100μg/μl的羧苄青霉素，12μg 5μg/μl的四环素，37℃，250rpm培养1h。
[0239]
(5)加入2.4μl 100μg/μl的羧苄青霉素继续培养1h；
[0240]
(6)加入1ml辅助噬菌体vcsm13(10
11-10
12
pfu/ml)，转移到500ml培养瓶，加入91ml sb培养基，加入46μl100μg/μl的羧苄青霉素，184μl5μg/μl的四环素，37℃，250rpm培养1.5h，加入140μl 50μg/μl的卡那霉素，37℃，250rpm过夜培养。
[0241]
(7)噬菌体抗体浓缩：将上一步菌液离心去菌体，收集上清(100ml)；加入4gpeg-8000和3g nacl，放入37℃，300rpm，5min促进溶解。冰上放置30min-1h。15000g，4℃离心15min。弃上清，将离心瓶颠倒放置在滤纸上放置10min干燥，小心移去多余液体。使用含1％ bsa的tbs 2ml重悬噬菌体(移液器上下混匀)，16000g，4℃离心5min，上清过0.22μm滤膜(millipore)，转移至2ml离心管。短时间可直接放冰上存储，或者加0.01倍体积的2％叠氮化钠放4℃，对于长时间存储加1倍体积甘油放-20℃存储。
[0242]
(8)取步骤(7)噬菌体，按照步骤(1)-(7)进行5轮筛选。
[0243]
(9)五轮筛选的抗体库的elisa鉴定：
[0244]
1)elisa 96孔板，每孔包被100ng的il-8；
[0245]
2)加入100μl噬菌体(2％脱脂奶粉稀释10倍)37℃孵育1h；
[0246]
3)0.05％的tbst洗涤5次；
[0247]
4)加入5％脱脂奶粉稀释2000倍的抗m13-hrp抗体(购自北京义翘神州生物技术有限公司)100μl，37℃孵育1h；
[0248]
5)0.05％的tbst洗涤5次；
[0249]
6)加入100μl tmb，避光显色5min；
[0250]
7)加入50μl 1m h2so4终止反应。
[0251]
8)使用酶标仪在450nm处测定吸光度。
[0252]
结果见图7和表19。
[0253]
表19 elisa鉴定第5轮筛选噬菌体库
[0254][0255]
3、il-8单克隆抗体鉴定
[0256]
(1)取第5轮筛选的il-8噬菌体，稀释10-7
，取1μl加入到200μl xl1-blue菌，室温放置15min；
[0257]
(2)将步骤(1)菌全部涂在含100μg/ml羧苄青霉素lb个体培养基上，37℃过夜培养；
[0258]
(3)挑选200个单克隆，加入到6ml的含10μg/ml四环素和100μg/ml羧苄青霉素的液体lb培养基中，37℃，250rpm培养4个小时，取少量菌液，进行菌液pcr鉴定，挑选能扩增出条带大小为1200bp的克隆。
[0259]
菌落pcr扩增体系见表20：
[0260]
表20
[0261]
菌液0.5μlvhseq(序列见前述的参考文献)0.2μlvlseq(序列见前述的参考文献)0.2μlddh2o4.1μlprimerstar5μltotal10μl
[0262]
菌落pcr反应条件见表21：
[0263]
表21
[0264][0265][0266]
(4)将步骤(3)的阳性克隆菌液均匀分成2份，一份入3μl辅助噬菌体vcsm13(10
11-10
12
pfu/ml)，室温放置20min，加入2.1μl 50μg/μl的卡那霉素，另外一份不加任何物质，37℃，250rpm过夜培养；
[0267]
(5)将加入辅助噬菌体的菌4000rpm离心10min，将上清转入干净离心管，上清进行10倍稀释，取100μl加入到包被il-8的酶联免疫板，37℃孵育1h，0.05％的tbst洗涤5次，加入2000倍稀释的抗噬菌体带hrp标记的抗体(购于北京义翘神州生物技术有限公司)，37℃孵育1h，0.05％的tbst洗涤5次，加入100μltmb，显色2min，加入50μl 1m的h2so4终止反应，使用酶标仪在450nm处测定吸光度，吸光度高于对照2.1倍的为阳性克隆。
[0268]
(6)挑选步骤(5)阳性克隆，没有加入辅助噬菌体的菌，提取质粒，并进行测序，获得重链可变区和轻链可变区序列。
[0269]
三、全人源化抗体的表达及活性鉴定
[0270]
1、全人源化载体构建
[0271]
(1)根据获得的抗体重链可变区或轻链可变区序列，设计相应的引物，分别扩增后，在重链和轻链n端都加入分泌信号肽，重链c端加入igg1的fc片段；
[0272]
(2)将重链可变区和轻链可变区分别同源重组到pcdna3.4载体。(见图8)
(pcdna3.4载体购自于武汉淼灵生物科技有限公司)
[0273]
2、全人源化抗体的表达
[0274]
(1)使用除内毒素中提试剂盒(购自omega)，分别提取对应的重链表达载体和轻链表达载体；
[0275]
(2)当293t细胞(购自于武汉普诺赛生命科技有限公司)融合度达到80％时，使用pei进行转染；
[0276]
(3)转染后12h，更换成无血清蛋白表达培养基，37℃，5％ co2培养7天；
[0277]
(4)使用protein a/g填料纯化抗体。结果见图9。
[0278]
3、全人源化抗体活性鉴定
[0279]
以il-8抗体活性鉴定为例
[0280]
(1)elisa鉴定
[0281]
将获得的抗体调整为浓度1mg/ml，使用5％的脱脂奶粉稀释2000倍，加入到包被il-8抗原的酶联免疫孔中，37℃孵育1h，0.05％的tbst洗涤5次，加入5％的脱脂奶粉稀释2000倍抗人fab-hrp二抗(购自于北京索莱宝生物科技有限公司)，37℃孵育1h，0.05％的tbst洗涤5次，加入100μltmb，显色2min，加入50μl1m的h2so4终止反应，使用酶标仪在450nm处测定吸光度。结果见表22。
[0282]
表22 elisa鉴定纯化后yx20与il-8结合
[0283][0284]
(2)利用yx20为固定抗体，yx5、yx20、yx40为检测抗体组合检测il-8蛋白如下：
[0285]
采用elisa夹心法进行检测，将单克隆全人源化抗体yx20包被elisa板，加入抗原il-8，加入筛选出来的yx5、yx20、yx40生物素标记抗体(生物素品牌：thermo，货号：vf300852)，并进行不同的组合，再加带hrp标记的链霉亲和素(品牌：thermofisher，货号：ve302151)，检测显色，颜色越深说明对il-8抗原捕获能力越强，同时也说明该对抗体适合于il-8抗原的检测。空白对照是指游离相不加入抗体，只加入带hrp标记的链霉亲和素。
[0286]
具体操作如下：
[0287]
1)elisa 96孔板，每孔包被100ng的yx20抗体；
[0288]
2)加入100μl il-8(250ng/ml)，37℃孵育1h；
[0289]
3)0.05％的tbst洗涤5次；
[0290]
4)加入用5％脱脂奶粉稀释2000倍yx5、yx20、yx40生物素标记抗体，37℃孵育1h；
[0291]
5)0.05％的tbst洗涤5次；
[0292]
6)加入5％脱脂奶粉稀释5000倍的带hrp标记的链霉亲和素，室温孵育10min；
[0293]
7)0.05％的tbst洗涤5次；
[0294]
8)加入100μl tmb，避光显色5min；
[0295]
9)加入50μl 1m h2so4终止反应。
[0296]
10)使用酶标仪在450nm处测定吸光度。
[0297]
结果见表23。
[0298]
表23夹心法鉴定抗体对检测il8
[0299][0300]
注：纵列包被相，横列检测相，od450吸光值。
[0301]
(3)中性粒细胞趋化抑制
[0302]
1)从人外周血分离中性粒细胞(天津灏洋，tbd lzs11131)，使用1640将中性粒细胞浓度调整为5x106个/ml；
[0303]
2)使用24孔trans-well板(corning costar,3415)，孔径3um，实验分为3组：空白组，下室加入400ul空白1640；阳性对照组，下室加入400ul含浓度10nmil8的1640；实验组，下室加入400ul含浓度10nm il8和5ug/mlil8抗体的1640；所有的3组，上室均加入200ul(浓度5x106个/ml)的中性粒细胞；
[0304]
3)5％ co2，37℃放置2h，丢弃上室，细胞计数仪计算下室细胞量。
[0305]
结果见表24和表25，图10。
[0306]
表24抗il8抗体抑制中性粒细胞对il8趋化
[0307][0308][0309]
表25抗il8抗体对中性粒细胞趋化抑制(单位：％)
[0310] 复孔1复孔2复孔3yx20100103.3582102110.0746306
[0311]
(4)抗il8抗体对肿瘤抑制
[0312]
1)将裸鼠分为2组，实验组和对照组，每组3只，实验开始前，每组裸鼠背部皮下均注射100ul 1x106个hct116肿瘤细胞(结肠肿瘤细胞)；
[0313]
2)3天后，对照组每只裸鼠腹腔注射200ulpbs，实验组每只裸鼠腹腔注射200ul含500ug抗il8抗体的pbs，每间隔3天注射一次；
[0314]
3)注射4轮后，注射最后一次第3天，处死裸鼠，摘取肿瘤，进行称量。结果见表26和图11。
[0315]
表26抗il8抗体对肿瘤抑制(单位：g)
[0316]
编号123control0.270.260.3yx200.060.030.19