一种用于筛选影响瓜类作物嫁接发育相关基因的方法

本发明涉及生物，更具体地涉及一种筛选影响瓜类作物嫁接发育相关基因的方法。

背景技术：

1、我国是西瓜、甜瓜等瓜类作物的生产与消费大国，在世界瓜类作物种植中占有十分重要的地位。

2、嫁接是克服瓜类蔬菜连作障碍、实现丰产优质的主要技术措施。近年来，随着二代及三代测序技术在嫁接发育生物学研究中广泛应用，大量植物嫁接发育关键基因被揭示，这些关键基因的功能验证则依托于crispr/cas基因编辑系统等转基因技术的运用，而葫芦科植物再生体系困难限制了通过转基因技术进行功能分析。

3、vigs最初是从茄科植物中作为基因沉默的快速方法开发而来，目前已成为各种植物功能基因组学研究的一个有力的工具，尤其是对于那些生命周期长、转化效率低、缺少成熟稳定的转基因技术的物种的研究。子叶注射法是葫芦科作物利用农杆菌接种引发vigs的最常见方法，该方法中将幼嫩的完全展开的子叶用携带重组病毒载体的农杆菌悬浮液浸透。由于葫芦科植物的叶片叶脉众多，一次注射很难渗透，往往从子叶不同位置需要注射多次才能完全浸透，这样就对苗子造成了较大的物理伤害。然而，侵染的幼苗往往需要三周以上的时间才能开始达到沉默现象，这时的瓜苗已经达到三到四片真叶的状态，在生产上并不适于嫁接，并且此种方式的沉默效率不高。

技术实现思路

1、针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种用于筛选影响瓜类作物嫁接发育相关基因的方法，目的在于解决现有技术中的一部分问题或至少缓解现有技术中的一部分问题。

2、将带有目的基因的vigs载体转化农杆菌侵染瓜类作物发芽的种子，调整农杆菌浓度od600＝0.4,23℃黑暗培养24h后播种，播种后约2周，瓜类作物幼苗相继达到基因沉默状态，经rt-qpcr技术检测，获得目的基因沉默植株，进行嫁接。

3、一种用于筛选影响瓜类作物嫁接发育相关基因的方法，具体包括以下步骤：(1)转化外植体的准备及选择；(2)构建重组病毒载体cgmmv-x且转化到农杆菌中；(3)侵染液的制备；(4)侵染发芽的种子；(5)嫁接与检测；(6)嫁接苗管理与生长发育观察；(7)观察嫁接苗的生长发育情况判断目的基因是否为影响嫁接的基因。

4、进一步地，步骤(1)中将种子浸种催芽至种皮微微张开，露出一定长度的胚根，平铺在9cm培养皿中。

5、进一步地，步骤(2)中按常规挑取农杆菌单克隆cgmmv-x(x：目的基因)，于含有50mg/l卡那霉素和50mg/l利福平的lb液体培养基中，在28℃200rpm的摇床中过夜培养，3000rpm离心10分收集菌体。

6、进一步地，步骤(3)中首先配置接种缓冲液(10mm mgcl2、10mm mes和100μm as)，现配现用，避光。然后用配置好的缓冲液悬浮菌体至od600＝0.4，即得到侵染液；

7、图2是用浓度为od600＝0.4的侵染液侵染葫芦种子(砧木)的流程图；

8、进一步地，步骤(4)中侵染发芽的种子如下：向步骤(1)装有待转化受体发芽的种子的培养皿中倒入上述侵染液，侵染液深度能淹没芽眼即可(不能完全淹没胚根，否则胚根会软化)，23℃黑暗培养24h，即完成侵染。将侵染过的种子置于无菌滤纸上吸去多余的菌液；然后播种。

9、进一步地，步骤(5)中的嫁接过程如下：当瓜苗长至一叶一心至两叶一心时，可以进行单子叶贴接或顶插接的方式进行嫁接。

10、进一步地，步骤(5)中的检测过程如下：根据嫁接的方式不同、目标基因的表达模式不同合理选择位置取样，利用qrt-pcr技术检测目的基因x的表达量。

11、图3是播种后12天进行嫁接及定量取样的示意图；

12、进一步地，步骤(6)中嫁接苗管理与生长发育观察：嫁接苗盖上盖子，置于生长箱保湿一周；根据实验设计定期观察嫁接苗生长发育情况。

13、本发明还涉及一种影响嫁接的基因，该基因通过采用本发明所述的方法筛选出来。

14、一种影响嫁接的基因，该基因为pin1b或xth9，基因pin1b的序列如seq id no：11所示，基因xth9的序列如seq id no：12所示。

15、pin1b基因或xth9基因的应用，应用在瓜类作物嫁接中，提高嫁接苗的成活率或接穗鲜重或spad值。

16、综上所述，本发明将vigs技术与嫁接相结合，提供一种用于筛选影响瓜类作物嫁接发育相关基因的方法。该方法将嫁接相关基因连接到vigs质粒上，以瓜类发芽的种子为转化受体，通过农杆菌浸泡的方式转化，然后播种，约两周得到相应基因沉默植株，再进行嫁接，以达到筛选基因的目的。该方法不会对苗子造成物理创伤，在达到沉默效果时的苗龄适合于瓜类嫁接。该方法的建立，为研究瓜类作物嫁接基因功能提供一种快速、有效的方法。

技术特征：

1.一种用于筛选影响瓜类作物嫁接发育相关基因的方法，具体包括以下步骤：(1)转化外植体的准备及选择；(2)构建重组病毒载体cgmmv-x且转化到农杆菌中，x代表目的基因的部分扩增序列；(3)侵染液的制备；(4)侵染发芽的种子；(5)嫁接与检测；(6)嫁接苗管理与生长发育观察；(7)观察嫁接苗的生长发育情况判断目的基因是否为影响嫁接的基因。

2.如权利要求1所述方法，步骤(1)采取如下过程：将种子浸种催芽至种皮微微张开，露出一定长度的胚根，平铺在9cm培养皿中。

3.如权利要求1所述方法，在步骤(2)中，构建重组病毒载体cgmmv-x的过程如下：扩增待研究基因片段x，与cgmmv载体相连接，热击法转化dh5α大肠杆菌感受态细胞，冻融法将含有基因片段x的质粒导入农杆菌gv3101。

4.如权利要求1所述方法，在步骤(3)中，侵染液制备过程如下：首先配置接种缓冲液10mm mgcl2、10mm mes和100μm as，现配现用，避光；然后用配置好的缓冲液悬浮菌体至od600＝0.4，即得到侵染液。

5.如权利要求1所述方法，步骤(4)过程如下，向步骤(1)装有待转化受体发芽的种子的培养皿中倒入上述侵染液，侵染液深度能淹没芽眼即可，不能完全淹没胚根，否则胚根会软化，23℃黑暗培养24h，即完成侵染；将侵染过的种子置于无菌滤纸上吸去多余的菌液；然后播种。

6.如权利要求1所述方法，步骤(5)过程如下，播种后约两周，侵染苗嫁接，根据嫁接的方式不同、目标基因的表达模式不同合理选择位置取样，利用qrt-pcr技术检测目的基因x的表达量。

7.如权利要求1所述方法，步骤(6)过程如下，嫁接苗盖上盖子，置于生长箱保湿一周；

8.一种影响嫁接的基因，该基因通过采用权利要求1所述的方法筛选出来。

9.如权利要求8所述影响嫁接的基因，该基因为pin1b或xth9，pin1b基因的序列如seqid no：11所示，xth9基因的序列如seq id no：12所示。

10.如权利要求9所述基因的应用，应用在瓜类作物嫁接中，提高嫁接苗的成活率或接穗鲜重或spad值。

技术总结
本发明涉及生物技术领域，更具体地说涉及一种筛选影响瓜类作物嫁接发育相关基因的方法，包括如下步骤：转化外植体的准备及选择、农杆菌的转化、侵染液的制备、侵染发芽的种子、嫁接及检测、嫁接苗管理与生长发育观察、观察嫁接苗的生长发育情况判断目的基因是否为影响嫁接的基因。该方法不会对苗子造成物理创伤，在达到沉默效果时的苗龄适合于瓜类嫁接。该方法的建立，为研究瓜类作物嫁接基因功能提供一种快速、有效的方法。

技术研发人员：黄远,张婷,熊木,吴香帅,李玲,王筱,别之龙,李东平,钱欣
受保护的技术使用者：华中农业大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/12