一种打破泊松分布形成反应隔室群的方法

本技术涉及高通量化学分析领域，具体涉及一种靶向反应复合物以及它们在打破泊松分布形成反应隔室群的用途。

背景技术：

1、细胞的异质性是普遍存在的生命现象，单细胞作为独立活动的生命个体，所展现出来的性质和差异性对于整个生命系统的发展起到了至关重要的作用。人体内的每一个组织、器官都涵盖多种细胞类型，并且每一种类型的细胞随着生物体生命活动状态的不同而会发生改变，如果将成千上万个单细胞进行研究，就会模糊细胞之间的异质性信息，因此理解复杂的机体的工作原理、了解每一种细胞类型的生命功能和免疫应答对于揭示人体组织、器官工作的机理和基因调控的规律极为重要。例如导致人体患癌的恶性肿瘤为高度异质性的组织，由多种表型的肿瘤细胞组成，而真正的恶性细胞与正常细胞混杂，往往只占整个组织的一小部分，因此进行单细胞的分析，可以判断哪些细胞具有抗药性、哪些细胞易于转移，在指导精准用药、预测病程发展和临床指导等领域有重要的作用。

2、在看似同质的细胞亚群中，单细胞之间的表达也可能不尽相同，基因组虽从根本上决定了细胞的行为如转录或翻译，但基因表达是一个随机的分子进程，与细胞生长时间、空间均有关，使基因组的分析并不能准确反映细胞间实际行为的差异性；蛋白质作为生命活动的主要承担者，对细胞差异性、动力学以及功能直接产生影响，但蛋白质在单细胞水平的定量分析、蛋白质扩增以及蛋白质序列的高效读取始终是巨大的技术壁垒；而rna作用于dna的下游、蛋白质上游，已经逐渐成为间接判断基因表达情况及蛋白质丰度的有力工具，因此对转录组进行分析，可以揭示单细胞水平上遗传物质及其表达的异质性和随机性。

技术实现思路

1、目前高通量单细胞测序技术存在诸多技术难题：其一是高通量单细胞的分离，应用最广的高通量单细胞分离方法主要通过荧光激活细胞流式分选术来完成，荧光激活流式分选术可以同时通过多光谱通道扫描上千个细胞，通量高、速度快，可精确定位单细胞分选的位置；可以进行特异与非特异性细胞的分选从而获得所需的细胞亚群，还可以实现多参数分析，在实际样品的分析中具有极大的优势，因此利用荧光激活流式分选对单细胞进行分离，使单细胞分隔在96或384微孔板中进行后续分析是目前在单细胞分析领域应用最广的技术之一(jaitin，et al.，science，343.776-779；ba gnoli，et al.，naturecommunications，9.2937.)

2、第二个技术难题是单细胞内微量内含物的扩增，以及为实现高通量的单细胞测序，如何在样品制备过程中对每个细胞进行标记，即引入细胞编码；并且由于扩增过程中存在偏差，如何对单细胞内每个转录本信息进行标记，即引入分子编码，如何将细胞编码与分子编码进行整合，实现细胞内含物的准确定量是科研工作者近几年来方法学上创新的重点。近年来，科研工作者发展了一种编码微球的技术，可用于高通量单细胞内含物信息的标记。

3、第三个技术难题在于实现微孔板内单细胞与单微球的高通量一对一配对，目前广泛用于微粒分选的荧光激活流式分选不适用于编码微球的分选，一是编码微球成本昂贵，由于荧光激活流式分选需要消耗大量的背景微球，这种方式会造成大量试剂浪费，二是微球大小往往与流式分选的耗材不匹配，三是分选效率低，单位时间内细胞与微球分选数量有限，无法实现高效的高通量单细胞与单微球一对一快速配对，距离临床对细胞总数的要求相去甚远，四是分选出的单微球容易破碎。

4、目前尚无能够将高通量捕获单细胞、无偏扩增微量单细胞内含物、全面分析单细胞内含物集成在一起的公开技术。但已有公开报道利用微流控技术高通量分析单细胞转录组。比如cell文章(macosko et al.，2015，cell：161，1202-1214；klein et al.，2015，cell161，1187-1201)报道的结合液滴微流控和编码微球的方法，基于泊松分布原理利用液滴微流控的方法配对捕获单细胞与单微球，单细胞裂解释放的mrna被与之配对的编码微球捕获，再经过逆转录和扩增，将单细胞mrna信息编码与放大，通过高通量测序与生物信息学方法分析大量大细胞mrna的表达情况。该方法中细胞与微球的捕获是基于泊松分布原理，大部分的液滴没有细胞，只有～1％的液滴含有单个细胞，再结合微球的泊松分布，有效分析目标进一步减少，只能实现对大量实际样品中少部分细胞的分析，这样可能会忽略掉样品中一些重要的细胞个体。另外该策略只适合分析对象数目较多的样品，对于一些稀有细胞(比如循环肿瘤细胞)，由于其样品中细胞数量太少(10-100/ml血液)，无法用该方法来实现单细胞分析。这些技术都仅限于分析单细胞的mrna，其他单细胞内含物无法进行分析，如基因组、mirna、蛋白组、甲基化dna、代谢产物、脂质体、磷脂等。目前公开的技术中，都没有涉及到高通量分析。

5、微流控芯片是近些年来新兴并且快速发展走向成熟的领域，它利用结构各异的微通道和形式多样的外加力场，对微量流体或样品在微观尺度上进行操纵、处理与控制，从而实现了传统实验室部分乃至全部功能在一块芯片上的集成。然而，常规微流控芯片的局限性也是非常明显的，其需要在芯片内部设计泵、阀与操作复杂的外部流体控制设备配合使用，技术门槛高，且一块芯片难以重复使用，当需要用不同的反应试剂对同一样本进行多层次、多尺度分析时需要消耗大量的芯片制作成本(macosko et al.，2015，cell，161，1202-1214；klein et al.，2015，cell，161，1187-1201；han et al.，2018，cell，172，1091-1107)。

6、第四个潜在的技术问题在于以往的测序方法在对实际样品进行分析的时候，目前已报道的基于编码微球的测序方法都需要先用荧光激活流式分选出目标细胞，再转移至各个分析平台上，而细胞内含物信息会随着细胞所处环境的变化而发生改变，导致最后测序结果反映的测序信息对比细胞当时所处的真实环境下的信息可能会有所偏差。

7、第五个技术难题在于稀有细胞的分离，当待分析的细胞数量非常稀少又需要对每个单细胞独立的转录组信息进行分析时，传统基于毛细管挑取、梯度稀释或者激光切割等技术人力成本高、耗时耗力、通量低，限制了稀有细胞的高通量快速分离及测序分析。

8、本技术主要聚焦于上面的第三类技术难题，即，在实现对多个细胞进行高通量分析时解决了单细胞与反应试剂的一对一配对问题，同时增加液滴对细胞与微球的共捕获率，解决了″双泊松分布″造成的低效。

9、为了解决上述技术问题，本技术提供了：

10、1.一种形成反应隔室群的方法，所述方法包括：

11、准备待检测物群，其由两个以上待检测物构成；

12、准备靶向反应复合物群，所述靶向反应复合物群由两个以上靶向反应复合物构成，所述靶向反应复合物包括载体、连接于载体上对应于待检测物的靶向配基、连接于载体上对应于待检测物的反应试剂、可选地包括连接于载体上对应于待检测物的标签分子；

13、使用所述待检测物群与所述靶向反应复合物群接触，形成结合物群；

14、由所述结合物自身或者由媒介物包裹所述结合物形成反应隔室群。

15、2.如项1所述的方法，其中，所述待分析物选自蛋白质、核酸、糖、脂、代谢物、多肽、细菌、病毒、细胞器以及细胞中的一种或两种以上，以及由它们形成的复合体，最优选所述待分析物为细胞。

16、3.如项1所述的方法，其中所述载体的形状选自正方体形、四面体形，球形、椭球形、章鱼形、碗形、红血球形的一种或两种以上；最优选为碗形和/或红血球形。

17、4.如项3所述的方法，其中所述载体的数量为所述待检测物数量的4倍及以上，优选为所述待检测物数量的10倍及以上，最优选为所述待检测物数量的10倍至30倍。

18、5.如项3或4所述的方法，其中所述载体为的最大直径为待检测物的1倍以上，优选其最大直径为待检测物的3倍及以上，最优选其最大直径为待检测物的4倍至10倍。

19、6.如项3至5的任一项所述的方法，其中所述载体由聚合物或小分子构成，优选为聚合物载体，进一步优选为聚苯乙烯载体聚苯乙烯或水凝胶制成，进一步该聚合物载体由聚苯乙烯制成，最优选该聚合物带有铁磁性或顺磁性。

20、7.如项1所述的方法，其中，所述靶向配基可以是天然或人造的，选自包括锁核酸和x na的核酸及其类似物、适配体、小肽、多肽、糖基化肽、多糖、可溶性受体、类固醇、荷尔蒙、促分裂原、抗原、超级抗原、生长因子、细胞因子、瘦素、病毒蛋白、细胞黏附分子、趋化因子、链霉亲和素及其类似物、生物素及其类似物、抗体、抗体片段、单链可变片段(scfv)、纳米抗体、t细胞受体、主要组织相容性复合体(m hc)分子、抗原肽-mhc分子复合物(pmhc)、dna结合蛋白、rna结合蛋白、细胞内或细胞表面受体配基中的一种或两种以上以及它们共同形成的多重配基、复合配基、耦合配基。

21、8.如项1所述的方法，其中，所述标签分子选自天然或人造的信息分子，包括：寡核苷酸条形码、寡肽或多肽条形码、由天然碱基与lna、pna、xna等非天然碱基构成的核苷酸、寡糖或多糖条形码、生色团(chromophoric group)和助色团(auxochrome group)、金属原子或离子、分子量可区分的小分子、嵌段聚合物、聚合物与骨架分子共价连接物中的一种或两种以上以及它们之间形成的复合体。

22、9.如项1所述的方法，其中，所述反应试剂是寡聚核苷酸引物、酶或小分子。

23、10.如项1所述的方法，其中，所述载体直径粒径分布系数cv小于20％。

24、11.如项10所述的方法，其中，所述载体表面涂覆有力学缓冲涂层；进一步优选涂覆有水凝胶涂层；最优选该水凝胶涂层带有铁磁性或顺磁性颗粒。

25、12.如项1所述的方法，其中，所述连接选自共价键、金属键、离子键、范德华力、包括氢键、机械键、卤键、硫族键、亲金作用、嵌入、重叠、阳离子-π键、阴离子-π键、盐桥、非金属原子间次级键、金属原子与非金属原子间次级键、亲金作用、亲银作用、双氢键和金键的次级键。

26、13.如项1所述的方法，其中，所述靶向配基与所述载体连接是通过所述反应试剂的连接、通过所述标签分子的连接或通过接头的连接；所述反应试剂与所述载体的连接是通过所述靶向配基的连接、通过所述标签分子的连接或通过接头的连接；所述标签分子与所述载体的连接是通过所述靶向配基的连接、通过所述反应试剂的连接或通过接头的连接。

27、14.如项6所述的方法，其中所述小分子为所述靶向配基、所述反应试剂、所述标签分子中的一项或两项以上。

28、15.如项1所述的方法，其中，所述媒介物是油性介质，优选含氟油性介质，或者固体介质，优选微孔板。

29、16.如项1所述的方法，其中所述两个以上待检测物是可以是相同或不相同的，且所述两个以上靶向反应复合物可以是相同的或者不相同的，当所述两个以上待检测物不相同且所述两个以上靶向反应复合物不相同时，所述靶向反应复合物包括连接于载体上对应于待检测物的标签分子。

30、本技术的技术方案实现的有益技术效果

31、采用本技术的技术方案，在实现对多个的待分析物(例如细胞)进行高通量分析的同时解决了待分析物(单细胞)与载体(单微球)的一对一配对问题，同时增加媒介物(液滴)对细胞与微球的共捕获率，解决了待分析物与载体配对时出现的″双泊松分布″现象造成的低效问题。通过使用红细胞形和碗形的载体(例如聚苯乙烯微球)以及相对于待检测物(例如细胞)尺寸较大且数量较多的载体，利用空间位阻效应进一步确保了″单细胞与单微球的一对一配对″这一目的的实现。通过在载体(例如聚苯乙烯微球)的表面包覆一层缓冲层(水凝胶层)，避免了在细胞与微球结合过程中细胞被碾碎的危险，减少了待检测物损失。本技术所采用的靶向复合物群具有至少一种反应试剂，实现了对待检测物的高通量分析。